Mst1/2 活性の喪失により、次のような症状が促進されます。

Jul 07, 2023

npj 再生医療第 7 巻、記事番号: 64 (2022) この記事を引用

1501 アクセス

2 引用

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

哺乳類の感覚有毛細胞 (HC) の再生能力は限られており、HC の死後は永久的な難聴につながります。今回我々は、in vitro RNAシーケンスを用いて、Hippoシグナル伝達経路がHC損傷と自己修復プロセスに関与していることを示した。 Mst1/2阻害またはYap過剰発現によってHippoシグナル伝達をオフにすると、特に支持細胞においてYAP核蓄積が誘導され、損傷後の過剰なHC産生とHC再生が誘導されます。機構的には、Hippo シグナル伝達のこれらの効果は Notch 経路と相乗的に作用します。重要なのは、過剰なHCはHCマーカーを発現するだけでなく、生体内で聴覚領域への神経接続を形成できる繊毛構造も持っていることです。まとめると、Hippo の調節は、哺乳類の蝸牛支持細胞の増殖、HC 再生、およびニューロンとの再接続を促進するための新しい戦略を示唆しています。

有毛細胞 (HC) の損傷は永久的な感音性難聴を引き起こし、世界中の何百万人もの人々に影響を与えています1,2。損傷を受けた成体哺乳動物の HC は再生能力を欠いています 3,4 が、支持細胞 (SC) は HC を再生するための潜在的な資源である 5,6。新生児哺乳類の蝸牛で HC が損傷すると、SC は有糸分裂再生を通じて、または幹細胞や前駆細胞を活性化した後の直接的な分化転換を通じて HC を再生できますが、この再生能力は非常に限られています 7、8、9、10、11。重要なことは、生後 1 週間後に HC のアブレーションが誘導された場合、生体内で HC の再生は起こらない 12,13 ということです。再生の根底にある相互作用とメカニズムについては、特に細胞損傷パラダイムの文脈においてさらなる研究が必要です。

Hippo シグナル伝達は、細胞の増殖、分化、生存、死の調節において多面的な役割を果たす、高度に保存されたシグナル伝達経路です 14。哺乳類では、Hippo 経路はセリン/スレオニンキナーゼである哺乳類無菌 20 様キナーゼ 1/2 (MST1/2) とラージ腫瘍サプレッサー 1/2 (LATS1/2) で構成されます。一方、Yes 関連タンパク質 (YAP) は、 Hippo 経路の主要な下流メディエーター 15、16、17。刺激を受けると、リン酸化された MST1/2-SAV1 は LATS1/2-MOB1a/b 複合体を活性化し、次に下流の転写エフェクター YAP をリン酸化して、Hippo-on18 と呼ばれる細胞質への局在化を促進します。リン酸化が存在しない場合、YAP は核へ迂回され (Hippo-off)、そこで転写補因子 Tead と協力して、細胞の増殖と分化に関与する標的遺伝子を制御します 19,20。

これまでの研究は、Hippo シグナル伝達の上方制御がほぼすべての腫瘍組織 21 で細胞増殖を促進し、細胞アポトーシスを阻害するため、腫瘍形成における Hippo シグナル伝達の重要な役割に焦点を当てていました 21、特に他のシグナル伝達経路とのクロストーク 22,23。比較マイクロアレイ解析により、Yap 欠損により誘導される遺伝子発現が Wnt シグナル伝達経路で変化し、これがゼブラフィッシュの HC (神経マスト) 再生に関連している可能性があることが実証されました 24。聴覚系では、Gnedeva et al. Yap の条件付き喪失は、コルチ器官の胎生期における細胞周期の終了と関連しており、感覚器官が大幅に小さくなることを報告しました 25。 Rudolf らによる発見。非哺乳動物の卵形嚢では、細胞損傷が抑制性の Hippo シグナル伝達を克服して再生増殖を促進するのに対し、哺乳類の卵形嚢における YAP-TEAD シグナル伝達の抑制は増殖の静止状態の維持に寄与することが示唆されました 26。 YAP の細胞局在の違いは、ニワトリの卵形嚢の再生能力を部分的に説明している可能性があります 27。しかし、Hippo シグナル伝達経路に関するほとんどの研究は、内耳における細胞増殖の阻害と細胞周期からの離脱の促進における Hippo シグナル伝達経路の機能に焦点を当てており、HC 再生促進への応用には焦点を当てていません。

この研究では、マウスの蝸牛における Hippo シグナル伝達に焦点を当て、それが HC 再生のプロセスに関与していることを発見しました。さらに、ネオマイシン傷害後にYAPの核蓄積が増加し、YAPの核への進入が促進されると新生仔マウスにおける過剰なHC生成が増加することも発見した。さらに重要なことに、我々の結果は、Sox9陽性支持細胞（SC）におけるMst1/2ノックアウト後に誘導された新たに生成されたHCが生体内で機能することを実証し、これは特に哺乳動物において注目に値する。

アミノグリコシド系抗生物質（ネオマイシンなど）は蝸牛HCに対する毒素として知られており、ネオマイシン治療後の蝸牛では心尖回転から基底回転にかけて進行性HC損失が見られました（図1a〜c、図S1）。一方、このような状況では増殖性SCはほとんど観察されず、これらは主に頂端回転に分布していました（図1d）。 SC 増殖に基づく分子機構を調査するために、正規化された RNA-seq データの主成分分析 (PCA) を実行して、2 つのグループ間およびグループ内の全体的な差異を調査しました。ネオマイシン処理細胞と対照細胞は PC1 に沿って別個のクラスターを形成し、これにより分散の 86% が説明されました。グループ内の分散は PC2 によって明らかになり、分散の 7% のみを占めていました。ボルケーノプロットとジーンオントロジー分析から、リボ核タンパク質複合体とリボソーム生合成が大幅に上方制御されており、これは細胞の増殖または再生に密接に関連していることがわかりました（図S2）。京都遺伝子とゲノム百科事典の経路解析により、Hippo や Notch を含む多数のシグナル伝達経路が HC 死または SC 増殖のプロセスに関与していることが示されました（図 1e）。私たちは、HC損傷後のHippoシグナル伝達の変化に焦点を当て、Hippoシグナル伝達経路およびその下流遺伝子のうち、Mst1、Lats1 / 2、Mob1b、およびAmotl2を含む56個の遺伝子がHC損傷および修復プロセスに関連していることを発見しました（図1f）。。

a P2 新生仔マウスの蝸牛を単離し、12 時間培養した後、1 mM ネオマイシンで 6 時間損傷し、10 μM EdU でさらに 5 日間培養しました。 b、c ネオマイシン損傷後、HC死は蝸牛の頂点から基部まで増加しました（ミオシン7a + HC、頂点：109.0±6.4;中央：76.7±6.7;基部：43.0±4.6）、およびSidakの二元配置分散分析とそれに続く二元配置分散分析多重比較テストにより、ミドルターンとベーサルターンに有意な差があることが示されました。 d HC損傷後に観察された増殖性SCはほとんどありませんでした（Sox2 / EdU二重陽性SC、頂点：2.4±0.6;中央：1.4±0.5;ベース：0.6±0.4）が、二元配置分散分析とその後のSidakの多重比較検定では次のことが示されました。頂点と中間のターンに大きな違いがあります。 e 京都遺伝子とゲノム百科事典 (KEGG) のトランスクリプトームデータのパスウェイ分析。 f HC損傷後のHippoシグナル伝達経路に関連する差次的に発現される遺伝子の相対発現レベルを示すヒートマップ。 (FDR < 0.01; 各条件の n = 3)。発現量の高い遺伝子は赤色で示され、発現レベルが比較的低い遺伝子は青色で示されます。 P2 マウスの g-i 蝸牛を解剖し、12 時間培養した後、1 mM ネオマイシンで 6 時間処理しました。さらに24時間培養した後、免疫組織化学的染色を実施した。対照群と比較して、対応のない両側スチューデント t 検定で分析された免疫組織化学染色および相対蛍光定量分析の結果は、Sox2+ SC (白色) における YAP (赤色) の核蓄積がネオマイシン損傷後に増加したことを示しました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。データは平均値±SEMとして示されています。スケールバー = 20 μm。

さらに、SCにおけるYAP核蓄積がネオマイシン傷害によって引き起こされる可能性があることを観察しました（図1g–i）。私たちの結果でも確認されたように（図S3）、YAPの核蓄積は胚から新生児までコルチ器で急速に減少することが報告されており（図S3）、これはYAPの細胞質から核への移行が蝸牛の再生能力と関連していることを示唆しています。細胞。

選択的 MST1/2 阻害剤 28 である XMU-MP-1 は、マウス蝸牛における Hippo シグナル伝達を薬理学的にオフにするために使用されました (図 2a)。 YAPはSC核内で増加し（図2b〜h）、Hippo関連下流遺伝子の発現は用量依存的に増加しました（図2i）。 XMU-MP-1インキュベーション後のコルチ器では、核YAPの比率が増加し、リン酸化YAPのレベルが減少しましたが、リン酸化LATS-1のレベルは減少しました（図2j、k、S4）。

a P2 新生マウスの蝸牛を分離し、培養しました。 12時間後、1μMまたは5μMのXMU-MP-1を24時間添加した。 b–g P2新生児対照および1μMまたは5μMのXMU-MP-1処理マウス蝸牛からのSox2+ SC（白）におけるYAP（赤）の分布。黄色の矢印は、YAP 核蓄積が対照群で非常に低かったことを示し、一方、白い矢印は、YAP 核蓄積が XMU-MP-1 群で増加したことを示します。 h 対照群および XMU-MP-1 処理群の SC の核および細胞質における YAP の相対蛍光を、一元配置 ANOVA に続いてダネットの多重比較検定で分析したところ、XMU-MP-1 が転座を有意に促進したことが示されました。 YAPを核に導入します。 i 外因性 XMU-MP-1 処理後の Hippo 経路関連遺伝子および下流遺伝子の相対 mRNA 発現レベルを、一元配置 ANOVA に続いて Tukey の多重比較検定で分析しました。 j、k コントロールグループとXMU-MP-1グループにおけるp-YAP、p-LATS、YAP、およびLATSのウェスタンブロットと相対蛍光定量化は、二元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定で分析されました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。データは平均値±SEMとして示されています。スケールバー = 20 μm。

次に、Mst1fl/fl/Mst2fl/fl を生成しました。 Sox9-CreERT2 / +トランスジェニックマウスは、in vivoでSCにおいて特異的にHippoをオフにし（図3a）、SCにおけるMst1 / 2の条件付きノックアウトがSC核へのYAP転座を促進することが確認されました（図3b、c）。図3dの概略図は、蝸牛の構造と細胞サブタイプを示しています。 Mst1fl / fl / Mst2fl / flトランスジェニックマウスとCre活性化のない野生型（WT）マウスの間に有意差がないことを確認しました（図S5）。 WT対照群にタモキシフェンを注射すると、生後7日目（P）7でEdU + / Sox2 + 細胞は観察されず、出生後SCが有糸分裂的に静止していることを示しました（図3e）。ただし、タモキシフェン注射により、Mst1 / 2ノックアウトマウスの感覚領域（SR）と大上皮隆起（GER）の両方でかなりの数のSox2 + / EdU + 細胞が発生しました（図3e-h）。具体的には、いくつかの Hippo シグナル伝達関連遺伝子が転写レベルと翻訳レベルの両方で変化しました (図 S6、S7)。

Mst1f1/f1/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+ マウスを使用して、Sox9+ SC 内の Mst1/2 をノックアウトし、Hippo シグナル伝達をオフにして YAP 核移行を促進しました。タモキシフェンは P1 ～ 2 に注射され、EdU は P2 ～ 7 に注射され、蝸牛は P7 に採取されました。 b 対照群と比較して、Mst1f1/f1/Mst2fl/flでははるかに多くのYAP核転座があった。 Sox9-CreERT2/+ マウス。核は白で囲まれています。対照と比較して、Mst1/2 ノックアウトグループではより多くの YAP が細胞核に移行しました。 c 対照マウスおよびMst1 / 2ノックアウトマウスのSCの核および細胞質におけるYAPの相対蛍光を両側対応のないスチューデントt検定で分析したところ、Mst1 / 2ノックアウトがYAPの核への転座を促進したことが示されました。 d コルチ器の断面図の模式図。 DC、ダイタース細胞。 PC、ピラーセル; IPhC、内指節細胞。 IBC、内側境界セル。 GER、大上皮隆起。 e-h 対照マウスではEdU+ SCはほとんど検出されず、二元配置分散分析とそれに続くSidakの多重比較検定により、SRとGERではSox2+ / EdU+ SCの数が有意に多く、Sox2+ SCの総量は減少していることが示されました。 Mst1f1/f1/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+ マウス。 i-m IHC と OHC の両方で多数の新たに生成された HC があり、Mst1f1/f1/Mst2fl/fl の IHC と OHC の両方で多くの Sox2+/Myosin7a+ HC が検出されました。 Sox9-CreERT2/+ マウス (i)、および二元配置分散分析とそれに続く Sidak の多重比較検定を実行して、有意差を示しました。 n Mst1f1/f1/Mst2fl/fl では、ミオシン 7a+/EdU+ HC はほとんど観察されず、蝸牛あたり約 0 ～ 2 個でした。 Sox9-CreERT2/+ マウス。 o Mst1/2ノックアウトマウスにおける生体内でのSC増殖の模式図。 p インビボでのMst1/2ノックアウトマウスにおける過剰なHCの模式図。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。データは平均値±SEMとして示されています。スケールバー = 20 μm。

ミオシン 7a は HC のマーカーとして使用され、Sox2 は SC マーカーとして使用されました 29,30。 P7 マウスの HC 層には、トランスジェニックマウスには多数のミオシン 7a+/Sox2+ 細胞が存在しましたが、対照の同腹子には何も観察されませんでした。内側 HC (IHC) と外側 HC (OHC) の両方の総数は有意に多かったものの、SC 層の Sox2+ 細胞の総数は、コントロールよりもトランスジェニックマウスの方が少なかった (図 3i、j、k)。さらに興味深いことに、トランスジェニックマウスではミオシン７ａ＋／Ｓｏｘ２＋細胞の数が有意に多く、蝸牛の頂点から基部に向かって減少傾向が見られた（図３ｌ、ｍ）。ミオシン 7a+ である一部の細胞は Sox2+ 核も有することが報告されており、これらは Sox2+ 細胞から新たに生成された HC であるが、まだ未熟な段階にあることを示唆しています 30,31。したがって、YAP核転座を介したSCのHCへの直接分化は、HCの数の増加とSCの数の減少をもたらした（図3f、j、k）。さらに、トランスジェニックマウスではまれなミオシン7a+/EdU+細胞が見つかり、有糸分裂HC生成の存在が示されました（図3n）。結論として、Mst1/2コンディショナルノックアウトマウスでは、YAP核転座を介したSCからの直接分化と有糸分裂生成の両方が同時に起こったが、直接分化が支配的な機構であった(図3o、p)。

Sox9 は、転写調節因子の Sox ファミリーのメンバーです。これは主に内耳の発達段階の SC で発現されます 32。 YAP核転座によって誘導される増殖性SCおよび過剰なHCの起源を特定するには、Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+; Rosa26-tdTomato/+ マウス系統は、Sox9-tdTomato+ SC の Mst1 および Mst2 を条件付きでノックアウトするために作成されました。結果は、増殖性 SC と分化した HC の両方が Sox9+ SC に由来することを示唆しました。さらに、まれにミオシン7a + / EdU + 細胞もSox9-tdTomato + 細胞に由来し、系統追跡されたSox9 + SCで有糸分裂によって生成されたHCに対応しました（図S8）。要約すると、過剰な HC のほとんどは Sox9-tdTomato+/EdU- であり、これもまた、Hippo シグナル伝達を阻害すると直接分化が HC 生成を支配し、これらの新しい HC が Sox9-tdTomato+ SC に由来することを示しています。

Mst1fl/fl/Mst2fl/fl で新しく生成された HC のサブタイプを特定する。 Sox9-CreERT2/+ マウス、vGlut3、Prestin、および Oncomodulin (OCM) を使用して、新しい過剰 HC を標識しました。 OHC領域のミオシン7a+細胞はプレスチンを発現し、IHC領域のミオシン7a+細胞はvGlut3を発現しました（図4a〜f）。以前の研究では、OCM 標識は主に OHC に限定されており、開発の初期段階では IHC で一部の免疫反応性標識が行われていることが示されました 33。驚くべきことに、我々の結果は、トランスジェニックマウスではほぼすべての新しいHCがOCM+であったのに対し、OCM免疫反応性は対照群のOHCでほぼ独占的に見られ、P7のIHC列では発現が非常に低かったことを示しました。この結果は、新たに生成された HC が元の HC とはある程度異なり、おそらくより未熟であることを示しました。

a – f Mst1fl/fl/Mst2fl/fl の過剰な異所性 HC。 Sox9-CreERT2/+ マウスを IHC マーカー vGlut3 および OHC マーカー Prestin で染色しました。 WT マウスと比較して、新たに生成された HC は、IHC および OHC 領域に位置しているにもかかわらず、OCM で標識されていました。 g ファロイジンを使用して不動毛構造を標識し、Tuj1 を使用して神経線維を標識しました。 P7 コントロールマウスでは、ファロイジンで標識された OHC の「V」字型構造と IHC の「-」字型構造が観察され、Tuj1 で標識された規則的な神経線維接続に囲まれていました。 h P7 Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+ マウス、再生 HC を含むほぼすべての HC は、OHC と IHC でそれぞれファロイジンによって標識された同様の形状の「V」構造と「-」構造を持っていました。 Tuj1 標識では、不規則な神経線維に囲まれた 1 ～ 2 列の内側 HC と 3 ～ 5 列の外側 HC が示されました。 i、j P7における対照マウスおよびトランスジェニックマウスにおけるファロイジンおよびTuj1染色の断面図。 k–m 電子顕微鏡下での WT マウスのコルチ器の頂端から基底回転までの毛様体構造の代表的な図。 n–p 同腹子 P7 Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+ マウスでは、頂端から基底回転まで減少した未熟な毛束が検出されました。コントロールマウスおよびMst1/2ノックアウトマウスの原位置でのIHCおよびOHC束の拡大図、およびわずかに長い微絨毛と頂端から基底回転までのキノシリウムを備えた未熟な異所性毛束の拡大図を右側に示します。 q Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+; Rosa26-tdTomato/+ マウスを使用してパッチクランプ実験を実施しました。 P1-2 でタモキシフェンを注射した後、P7 で蝸牛を採取したため、Sox9-tdTomato+ HC を顕微鏡で観察できました。 r 上記の電圧ステップによって引き起こされる WT P7 OHC の代表的な外向き K+ 電流。 ■ 上記と同じ電圧ステップによって誘発されたトランスジェニックマウスの再生 HC の代表的な外向き K+ 電流。 t WT P7 OHC (n = 10) および再生 HC (n = 19) の 0 mV 脱分極に応答した IK (遅延整流器カリウム電流) の平均 ± SEM。 u WT P7 OHC および再生 HC の平均 ± SEM ピーク電流-電圧関係。データは平均値±SEMとして示されています。スケールバー = 20 μm (a ～ f、g、h)。スケールバー = (k – p) で、それぞれ低倍率で 5 μm、高倍率で 2 μm。

Tuj1 は、生体内で再生された HC 様細胞に囲まれた聴覚神経突起を標識するために使用されました。対照マウスでは、1 列の IHC と 3 列の OHC が神経線維接続で囲まれていました。対照的に、トランスジェニックマウスには1〜2列のIHCと3〜5列のOHCがあり、冠状断面と軸断面の両方で見られるように、各HCの周囲の神経突起はSRまで成長しました（図4g-j）。蝸牛HCの不動繊毛は、両グループのOHCでは認識可能な「V」字型構造、IHCでは「-」字型構造として配置されていましたが、再生されたHCの繊毛は、トランスジェニックマウスではわずかに組織化されておらず、整列していませんでした。ネズミ。走査型電子顕微鏡を使用して、新しく再生されたHCの繊毛をさらに視覚化したところ、P7で新しいHCに未熟な毛束が見つかりました（図4k-p）。これらの結果は、WT マウスと比較して同様ではあるが未熟な毛様体構造を有する、in vivo で新たに生成された HC の状態の証拠を提供します。さらに、Sox9 + SCにおけるMST1 / 2のノックアウト後、FM1-43FX色素の緑色蛍光がtdTomatoと同時標識され、新しいHCが機能的な形質導入チャネルを持っていることが示されました（図S8i）。

これらの過剰な HC で全細胞パッチクランプ実験を実行しました。コルチ器の発生過程における HC と同様に、持続的な外向き K+ 電流が新たに生成された HC に記録されました。これらの結果は、生体内で再生されたHCがいくつかの伝達チャネルと電気生理学的機能を持っていることを示しました（図4q-u）。

インビトロでのネオマイシン損傷蝸牛におけるXMU-MP-1の効果を図5aに示します。 XMU-MP-1処理により、対照蝸牛と比較してより多くのMyosin7a+/Sox9-tdTomato+細胞が生成されることがわかりました（図5b、c）。数値的には、XMU-MP-1 処理グループではより多くの Sox9-tdTomato+/Myosin7a+ 細胞が見つかり、頂点から基部に向かって減少パターンが見られました (図 5d)。これは、多数の Sox9+ SC が直接分化したことを示しています。 XMU-MP-1 に応答する HC。

Sox9-CreERT2/+; Rosa26R-tdTomato/+ および Atoh1-CreEsr1/+。 Rosa26R-tdTomato/+ マウスモデルを使用して、SC および HC 系統を追跡しました。 P1 でタモキシフェンを注射して tdTomato 発現を一晩活性化し、蝸牛を P2 で採取し、その後 in vitro で培養しました。ネオマイシンに 6 時間曝露した後、蝸牛外植片を外因性 XMU-MP-1 または 0.5% DMSO で 5 日間培養しました。 b – d 対照と比較して、二元配置分散分析とそれに続くSidakの多重比較検定で分析したXMU-MP-1治療グループでは、ミオシン7a + / Sox9-tdTomato + HCの数が心尖部から基底部まで大きく増加していました。 e – g 二元配置分散分析とその後の Sidak の多重比較検定で分析した対照と比較して、XMU-MP-1 治療グループには多数の Myosin7a+/Atoh1-tdTomato- HC が存在しました。 h XMU-MP-1処理後のMyosin7a+/Sox9-tdTomato+ HCの概略図。 i XMU-MP-1 処理後の Myosin7a+/Atoh1-tdTomato- HC の概略図。 j、k P2 WT マウスからの蝸牛外植片を採取し、培養しました。ネオマイシンに 6 時間曝露した後、外植片を外因性 XMU-MP-1 または 0.5% DMSO で 24 時間培養しました。免疫組織化学的染色の結果、XMU-MP-1 の添加により、ネオマイシン損傷後の Sox2+ SC における YAP1 の核蓄積が有意に増加することが示されました。 l、m ネオマイシン損傷後、蝸牛をDMSOまたはXMU-MP-1とともにさらに5日間培養し、増殖細胞を追跡するために10μM EdUを常に添加した。 DMSO 処理を行った対照グループでは、増殖している HC は検出されず、SC はほとんど検出されませんでした。 XMU-MP-1 治療グループでは、心尖部から基部回転までいくつかの EdU+ SC および HC がありました。 n EdU+ HC は主に内側 HC と外側 HC の間のトンネル内に分布しており、ほとんどがペアで出現し、Sox2 で染色されました。 o–q 対照群と比較して、二元配置分散分析とそれに続く Sidak の多重比較検定で分析した in vitro での XMU-MP-1 添加後に、増殖している SC および HC の数が大幅に増加しました。 HC の総数は大幅に増加しました。 r–t 心尖部ターンにおけるHCの割合の増加と比較すると、HCの約16％のみがEdU+であった。ｓＨＣ：過剰ＨＣ。 u 有糸分裂的に再生された HC と増殖中の SC の模式図。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。データは平均値±SEMとして示されています。スケールバー = 20 μm。

bHLH 転写ファミリーのメンバーである Atoh1 は、初期の内耳 HC 発生に必要かつ十分です 34。 Atoh1-CreEsr1/+ で; Rosa26R-tdTomato/+ マウスでは、対照グループではほとんどの HC が Atoh1-tdTomato+ であったのに対し、トランスジェニックマウスでは Myosin7a+/Atoh1-tdTomato- 細胞が IHC と OHC の間のトンネル内にあることがわかりました（図 5e）。 –g)。これらの結果は、XMU-MP-1がネオマイシン傷害後のHC分化を有意に増加させ、再生されたHCはほとんどがAtoh1-tdTomato + HCからではなくSox9 +前駆体から分化したことを示しました（図5h、i）。ネオマイシン損傷のないHC層におけるSox9-tdTomato+細胞とAtoh1-tdTomato+細胞の分布を図S9a、bに示しました。

WT マウスでは、XMU-MP-1 の添加により、ネオマイシン損傷後の Sox2+ SC における YAP1 の核蓄積が有意に増加し（図 5j、k）、ミオシン 7a+/EdU+ 細胞は存在しませんでしたが、ネオマイシン中にいくつかの Sox2+/EdU+ 細胞が見つかりました。対照群。逆に、XMU-MP-1 処理蝸牛では、Sox2+/EdU+ 細胞と Myosin7a+/EdU+ 細胞の両方の数の大幅な増加が見られました (図 5l-q)。興味深いことに、ほぼすべての Myosin7a+/Sox2+/EdU+ 細胞がペアで存在していました。さらに、有糸分裂的に増殖する HC のほとんどが IHC と OHC の間に位置し、前駆細胞が豊富な領域であることがわかりました 7 (図 5n)。これらの結果は、Hippo シグナル伝達の調節が、蝸牛損傷の場合に有意により多くの SC 増殖を誘導する状況依存性の SC 増殖調節因子である可能性を示唆しました。さらに、有糸分裂により生成されたHC（EdU + / Myosin7a + / Sox2 +）は、無傷の蝸牛と比較して明らかに増加しました（図S9c、d）が、これらはまだ、インビトロでのYAP核転座誘導性HC再生に起因する主要な細胞タイプではありませんでした（図S9c、d）。 .5q–u）。

上記の結果が示すように、ネオマイシン損傷後、SC核内でYAPタンパク質が増加しました（図1g-i）。さらに、XMU-MP-1は、無傷の状態（図2b〜g）だけでなく、ネオマイシン損傷状態（図5j、k）でも用量依存的にSC内のYAP核移行を促進しました。 YAPの核移行がHC再生と関連しているというさらなる強力な証拠。

次に我々は、Hippo の電源を切ると YAP 核移行の刺激を通じて過剰な HC の生成が始まるかどうかを調べました。アデノウイルスを蝸牛外植片の効率的なトランスフェクションのためのベクターとして使用し、Yap1 を過剰発現する組換えアデノウイルス (Ad-YAP および Ad-YAP-GFP) を生成しました。さらなる分析のために、最適濃度の 3 × 109 PFU/ml アデノウイルスが選択されました (図 6a-g)。 Ad-YAP処理蝸牛では、ミオシン7a+細胞とミオシン7a+/EdU+細胞の両方の数の大幅な増加が見られました（図6h〜k）。これらの結果は、有糸分裂により生成された HC と比較して、直接分化が HC 再生を支配していることを示唆しました。

a ネオマイシンに6時間曝露した後、蝸牛外植片を外因性Ad-GFP / Ad-Yap-GFPとともに48時間培養し、SRのSox2+ SCでGFP蛍光に基づくトランスフェクション効率を分析しました。 b、c GFP+/Sox2+ 細胞を計数したところ、アデノウイルス濃度の増加（107、108、109、3 × 109、および 1010 PFU/ml）に応じてトランスフェクション効率が増加することが示されました。 d さまざまな濃度のアデノウイルスで処理した Sox2+ SC の数を計算しました。高濃度ではSCの数がわずかに減少することが判明した。 e、f Yapの発現を上方制御するために、6時間のネオマイシン傷害後の蝸牛外植片をAd-Yap-GFPで48時間処理した。 1 サンプル t 検定を実行したところ、YAP は 3 × 109 PFU/ml アデノウイルスの濃度で有意に増加し、核内の YAP の分布が有意に増加したことが示されました。 g Ad-Yap-GFP処理後のHippoシグナル伝達および下流標的遺伝子の相対mRNA発現レベル、および二元配置ANOVAとそれに続くSidakの多重比較検定を実行して、有意差を示しました。 h – k ネオマイシンに6時間曝露した後、蝸牛外植片をAd-mus-Yap1またはAd-nullとともに7日間培養し、増殖細胞を追跡するために10μM EdUを常に添加しました。 Ad-null 処理を行った対照グループでは、増殖している HC または SC は検出されませんでした。 Ad-mus-Yap1 治療グループでは、二元配置分散分析とそれに続く Sidak の多重比較検定で分析した、心尖部から基部回転までの EdU+ SC および HC が有意に多かった。対照と比較して、HC の数は、二元配置分散分析とそれに続く Sidak の多重比較検定で解析された、心尖部から基部回転まで有意に増加していました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。データは平均値±SEMとして示されています。 (b) および (h) ではスケールバー = 20 μm、(e) ではスケールバー = 10 μm。

我々の以前の研究では、Wnt 活性化と Notch 阻害の協調制御が、出生後のマウス蝸牛における HC 再生を促進できることを発見しました 7,35。ネオマイシン損傷後の蝸牛の転写物を分析することにより、STRINGを使用したタンパク質相互作用ネットワーク分析により、Hippo、Notch、およびWntシグナル伝達経路関連遺伝子の発現が再生過程で著しく変化することが示されました（図7a）。 RT-qPCR の結果は、Hippo 阻害には、HC 形質転換 (Atoh1、Brn3.1)、Notch シグナル伝達経路 (Jag1、Hes1、および Hes5)、および Yap/Taz およびその下流エフェクター遺伝子 (ACTG) に関連する遺伝子の上方制御が伴うことを示しました。ネオマイシン損傷後のXMU-MP-1処理蝸牛におけるAmotl2）（図7b）。

Hippo、Notch、および Wnt シグナル伝達経路の差次的に発現される遺伝子のタンパク質間相互作用ネットワーク分析。紫色の線は Hippo 遺伝子と Wnt 遺伝子間の相互作用を示し、オレンジ色の線は Hippo 遺伝子と Notch 遺伝子間の相互作用を示します。ノードの色は、遺伝子発現倍率変化を示します。 b P2 野生型マウスからの蝸牛外植片を採取し、培養しました。ネオマイシンに6時間曝露した後、外植片をXMU-MP-1またはDMSOとともに24時間培養した。 XMU-MP-1 処理グループとコントロール間の関連する mRNA 発現レベルが示され、二元配置分散分析とそれに続く Sidak の多重比較検定を実行して有意差を示しました。 c P2 WT マウスからの蝸牛外植片を採取し、培養しました。ネオマイシンに 6 時間曝露した後、外植片を外因性化合物 (XMU-MP-1、BIO、または DAPT を含む) または 0.5% DMSO で 3 日間培養し、増殖細胞を追跡するために 10 μM EdU を常に添加しました。 d – g HCとEdU + HCの総数は、XMU-MP-1処理グループとXMU-MP-1 / BIO処理グループの間で有意な差はありませんでした。 e、h、i 再生 HC の数は、XMU-MP-1 治療群と比較した場合、XMU-MP-1/DAPT 治療群で有意に増加しました。 j 二元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定を実行し、BIO による Wnt シグナル伝達の上方制御が SC の増殖を促進する可能性があることを示しました。しかし、XMU-MP-1/DAPT の共制御により、EdU+ HC を含むより多くの HC が生成され、GER 内で多数の増殖性 SC が見つかりました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。データは平均値±SEMとして示されています。スケールバー = 20 μm。

さらに、他の信号とHippoをオフにすることの相乗効果/拮抗効果を調査しました（図7c）。 Hippoシグナル伝達を単独でオフにした場合、SR内のいくつかの増殖中のSCおよび再生されたHCが観察されました（図7d、e、j）が、多数の増殖中のSC（SRおよびGER内）および直接分化したHCはほとんど観察されませんでした。 Wnt経路が単独で（BIOにより）活性化された場合（図7f、j）。 HippoをオフにすることとWnt活性化を組み合わせた場合、SR内でいくつかの増殖中のSCと再生されたHCが観察されました（図7g、j）。 Hippo 不活化/Wnt 活性化を組み合わせたグループにおける SC の増殖は、Wnt 経路活性化単独と比較して有意に阻害されましたが、特に SR において Hippo シグナル伝達経路制御単独の場合と類似していました。一方、直接分化したHCはWnt活性化の影響を受けず、その数はHippoシグナル伝達のみをオフにした場合に見られるものと同様であった。これらの結果は、Wnt 活性化と Hippo 不活性化には明らかな相乗効果がないことを示しています。

最後に、Notch経路が単独で阻害された場合、いくつかの増殖中のSCと多数の直接分化したHCがSRで観察され（図7h、j）、Hippoの上方制御がNotch抑制と組み合わせられた場合、多くの増殖中のSCと再生されたHCが観察された（DAPTあり）（図7I、j）。具体的には、ＳＣの増殖は、Ｎｏｔｃｈ阻害単独で見られたものと比較して、ＳＲにおいて有意に減少したが、ＳＣの増殖は主にＧＥＲで見られた。また、直接分化した HC の数は、Hippo のみをオフにした場合と比較して大幅に増加しました。これらの結果は、特に SC から HC への直接分化の促進において、Hippo 経路に対する Notch シグナル伝達の顕著な相乗効果があることを示唆しています。結論として、Hippo/Wnt/Notch の制御、特に Hippo と Notch の組み合わせが内耳 HC 再生に重要な役割を果たしているようです。

Hippo-YAP シグナル伝達は、組織の恒常性、器官のサイズ、幹細胞の重要な調節因子です 36。ネオマイシン処理したLgr5+前駆体と無傷のLgr5+前駆体間の以前のRNA配列分析では、Hippo経路遺伝子の中でBmpr2、Wnt7a、およびFzd7が上方制御されている一方、Id1、Id2、およびId3が下方制御されていることが明らかになりました。本研究では、Hippo シグナル伝達に焦点を当て、56 個の Hippo 関連遺伝子が HC 損傷および自己修復プロセスに関連していることが示されました。私たちの結果は、損傷と修復の生物学的プロセスが損傷した蝸牛に同時に存在することを示しました。

Hippo シグナル伝達は状況依存性調節因子として、さまざまな細胞サブタイプの細胞増殖、分化、アポトーシスに関与しています 38。 YAP は、Hippo 経路のエフェクター分子として、胚発生の非常に初期段階における特定の細胞仕様に必要です 20,39。グネデヴァら。は、有糸分裂後感覚性ドメインの確立前のコルチ前駆細胞の器官の増殖状態の維持におけるYAPの役割を特徴づけました25。損傷に応答して、Hippo 非依存性シグナル伝達が YAP の効果を促進して悪性転換を防ぐ可能性があります 40。今回我々は、新生マウス（P2）におけるYAPの細胞内パターンを示した。YAPは主に細胞質に分布し、細胞核には弱いシグナルのみが存在する。 YAP の細胞質核移行はネオマイシンによって開始されました。これらの結果は、YAP 核蓄積が HC 損傷と自己修復の過程で重要な役割を果たしている可能性があり、YAP 核蓄積の調節が損傷後の HC 再生に重要である可能性があることを示唆しています。

Hippo シグナル伝達は、生化学的フィードバックループを通じて恒常性の維持と器官サイズの維持に重要な役割を果たしています 19,41。 Hippo シグナル伝達が哺乳類の肝臓組織の増殖、生存、分化を調節することによって器官のサイズを調節し、恒常性レベルに達することが広く報告されています 42、43、44、45。最近の研究では、発生中の内耳前駆細胞の維持における Hippo 経路のエフェクター分子である Yap/Tead 転写因子複合体の役割が強調されています 25,26。他の研究では、出生後の心筋細胞におけるYAPの活性化が、心筋再生治療における心筋細胞の拡大を刺激できることが示されています46,47。ここで我々は、新生児哺乳動物蝸牛細胞における HC 損傷後の Yap 発現と局在の役割を報告しました。 Hippo 経路の下流遺伝子は XMU-MP-1 によって上方制御されており、これは SC の再プログラミングと HC の再生プロセスに密接に関連している可能性があります。

上流キナーゼの喪失または YAP の活性化により、前駆細胞の増殖と細胞運命の決定が制御される可能性があることが報告されています 39,48。内耳における Hippo シグナル伝達経路の影響を調査するために、我々は Hippo シグナル伝達経路を薬理学的に阻害して in vitro で YAP 核移行を誘導し、さらに Mst1/2 コンディショナルノックアウトマウスを使用して内耳における Hippo 阻害の役割を検証しました。生体内で。我々は、多数のSCの増殖を観察したが、これは他の臓器の成長と発達を調節する既知の機能と一致していた20。さらに重要なことは、インビボでトランスジェニックマウスにおいてSCからのHCの増殖生成と直接分化が観察され、YAPの核移行がインビトロでネオマイシンで損傷したHCを補充することができたことである。具体的には、増加した HC の 80% 以上が非増殖性であり、これは直接分化が Hippo 阻害に応答した HC 生成の主要なプロセスであり、これが SC の限られた増殖と密接に相関している可能性があることを示しています。さらに、Mst1fl/fl/Mst2fl/fl を使用しました。 Sox9-CreERT2/+; Rose26-tdTomato/+ マウス系統は、ほぼすべての過剰 HC が Sox9+ SC に由来していることを示しています。これらの結果は、Hippo 阻害が内耳の異なる細胞サブタイプ間の動的なバランスを維持することによって SC 増殖を促進し、過剰な HC 生成を誘導できることを示しました。さらに、我々の結果は、YAPの核転座がより多くの有糸分裂生成を開始し、ネオマイシンで損傷したHCを補充するためにHCへの分化を誘導することができることを実証したが、これはHippoシグナル伝達によって調節されるフィードバック機構である可能性がある。 HC の再生により SC の数が減少し、SC の増殖が誘導され、それが新たな HC の生成につながりました 49。これらのプロセスは独立して存在するのではなく、閉ループ内の動的なバランスを通じて相互に影響を与える可能性があります。

ネオマイシン損傷とXMU-MP-1によるMST1/2キナーゼの不活性化が、主にSCの直接分化を介して、一部のEdU+ HCを伴う感覚細胞運命獲得を用量依存的に誘導することは注目に値する。しかし、トランスジェニック法によりMST1/2をノックアウトした損傷を受けていない蝸牛では、少数の増殖したSCまたは未熟な過剰なHCを除いて、広範な細胞増殖を見つけることができませんでした。私たちは、この矛盾はネオマイシンで損傷した微環境と無傷の微環境の違いによるものではないかと仮説を立てました。以前に報告されたように、損傷は、特に鳥や魚などの非哺乳類の種において、いくつかの HC 再生メカニズムを引き起こす可能性があります 50,51。対照的に、哺乳類の HC は自然に再生できません。本研究では、MST1/2阻害またはYap過剰発現によるHippo-offは、特にSCにおいてYAP核蓄積を誘導し、ネオマイシンなしでは少数の過剰なHCを誘導するか、ネオマイシン損傷によりHCの数が増加すると結論づけた。ビトロ。我々の結果は、損傷状態では、Hippo シグナル伝達が SC の障壁を取り除き、SC を直接 HC に分化させる可能性があることを示しています。このメカニズムについては、今後さらに研究する必要があります。

構造的に、HC と脳の聴覚中枢の間には神経接続があります。 Mst1fl/fl/Mst2fl/fl で; Sox9-CreERT2/+ マウスモデルでは、新たに生成された HC が神経突起伸長を促進できることがわかりました。重要なことに、神経線維の形成が生体内で観察されたことは、その場での過剰なHCの生成がHCとニューロンの間の接続を引き付けるという仮説を裏付けるものであり、このことは、新しいHCが神経接続を再構築し、したがって聴覚を回復する可能性があることを示唆している損失。しかし、HC の再生能力は、in vivo および in vitro で年齢とともに急速に低下します 12,13。したがって、今後の研究は、哺乳類の聴覚を回復するための新しい戦略を開発するために、これらのプロセスの背後にある根本的なメカニズムを理解することに焦点を当てる必要があります。

以前の研究では、YAP/TAZ の機械的活性化が Notch シグナル伝達の阻害を通じて表皮幹性を促進すると報告されており 52、多くの研究により、Hippo、Wnt、Notch シグナル伝達経路は独立して機能せず、それぞれのシグナル伝達経路に影響を与える可能性があることが示されています。その他47,53,54,55。 Wnt シグナル伝達の活性化が SC の増殖を促進し、Notch シグナル伝達の阻害が HC 再生を刺激することも報告されました 7,35。ここで我々は、再生促進におけるカバの機能に対するこれら 2 つの古典的なシグナル伝達経路の影響を調査しました。 YAP と Notch シグナル伝達間のクロストークは、細胞発生、細胞分化、細胞運命決定、形態形成、炎症、上皮間質相互作用、および大規模な遺伝子振動に影響を与えます 56。 YAP/TAZ は Jagged-1 発現を活性化し、したがって神経堤における Notch 依存性の平滑筋分化を促進することが報告されています 55。我々の研究では、Hippo 単独の制御と比較して、Wnt 経路と Hippo 経路を組み合わせた制御によって SR における SC 増殖または HC 再生の明らかな増加は見られませんでした。しかし、一度に単一のシグナル伝達経路を調節する場合と比較して、Notch経路とHippo経路の複合調節に応答して、SRではより多くのSC増殖とより多くのHC再生が存在した。これらの結果は、Notch 経路の阻害が Hippo シグナル伝達に対して相乗的かつプラスの調節効果をもたらすことを示唆しており、これらの仮定を直接検証するために、これらの経路の逐次的調節についてさらなる研究を進める予定です。

結論として、Hippo 阻害に応答した YAP 核蓄積は、新生マウスにおいて軽度の SC 増殖を促進し、過剰な HC 生成を誘導する可能性があり、特に主に蝸牛の頂端から中回転部におけるネオマイシン損傷とともに直接的な SC 分化転換を促進します。我々は、Hippo 阻害が HC 再生に及ぼすプラスの効果について十分な証拠を提供し、Notch および Wnt シグナル伝達経路との相乗効果を示しており、これが SC の増殖、HC 再生、および哺乳類の内部ニューロンとの再接続を促進するための新しい戦略につながることを期待しています。耳。

すべてのトランスジェニックマウス (上表 1) は、Jackson Laboratory から入手しました。 Cre の活性化のために、コーン油に溶解した 15 μl のタモキシフェン (Sigma) を P1-2 マウスに腹腔内注射しました (40 mg/ml)。増殖細胞を検出するために、20 μl のチミジン類似体 EdU (Click-iT EdU Imaging Kit; Invitrogen) を P2-7 新生仔マウスに腹腔内注射しました (5 mg/ml)。

私たちは動物実験と研究に関連するすべての倫理規制を遵守しました。すべての動物実験は、復旦大学の動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールに従って実施され、使用される動物の数を最小限に抑え、苦痛を避けるためにあらゆる努力が払われました。

Viagen DirectPCR DNA Extraction System (Viagen) を使用して尾端から抽出したゲノム DNA を使用して、トランスジェニックマウスの遺伝子型を特定しました。ジェノタイピングプライマーは補足表2に提供されています。

全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、血管条の基部、小体部、および蓋膜を除去した蝸牛から抽出した。 cDNA合成およびqPCRは、PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara)およびTB GreenTM Premix Ex TaqTM II (Takara)を使用して実行されました。各 PCR は 3 回実行し、Gapdh を内因性参照としてΔΔCT 法を使用して遺伝子発現の相対定量を実行しました。プライマーペアはオンライン Primer3 ソフトウェアを使用して設計され、配列は補足表 3 に示されています。

P2 新生仔マウスの蝸牛を無菌条件下で単離し、血管条、小体、および蓋膜の基部を細い鉗子で除去し、Corning® Cell-Tak™ 細胞および組織接着剤でプレコートした 10 cm のカバースリップ上に置きました。臓器全体を、4ウェルペトリ皿内のN2/B27 (Invitrogen)およびアンピシリンナトリウム溶液(Sangon Biotech)を補充したDMEM/F12培地中で培養した。 HC傷害については、12時間培養後にネオマイシン(1mM、Sigma)を添加し、増殖細胞を検出するために10μM EdUを添加した。 in vitro の蝸牛培養モデルでは、1 mM および 5 mM XMU-MP-1 (Selleck)、5 μM DAPT (N-[N-(3,5-ジフルオロフェンアセチル)-L-アラニル]-S-フェニルグリシン t-ブチルエステル、γ-セクレターゼセクレターゼ阻害剤)、および 5 μM BIO (6-ブロモインジルビン-3'-オキシム) を添加して、Wnt および Notch シグナル伝達経路の生物活性を調節しました。

組換えYap過剰発現アデノウイルスベクターを構築するために、pAd/CMV/V5-DEST Gateway® Vector、pAd/PL-DEST Gateway® Vector、および293細胞株（Invitrogen、Carlsbad、California、USA）を調製しました。 Yap のマウス cDNA (NM_001171147CDS) をアデノウイルスベクターに挿入しました。消化されたベクターと挿入セグメントを T4 DNA リガーゼで連結しました。ウイルスプラスミドの大規模な抽出とパッケージングが実行され、続いて収集と増幅が行われました。最終的に、力価 1.2 × 1010 PFU/ml の組換えアデノウイルスが得られました。蝸牛外植片トランスフェクションの場合、組換えアデノウイルス (Ad-null、Ad-GFP、Ad-YAP、および Ad-YAP-GFP) を培地に添加し、48 時間インキュベートしました。組換えウイルスの濃度は、107、108、109、3×109、および1010 PFU/mlでした。免疫組織化学的標識のために組織を調製し、アデノウイルスのインキュベーションの 7 日後に分析しました。

組織を、0.1 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中の 4% パラホルムアルデヒドで 10 分間固定しました。ＰＢＳで３回洗浄した後、組織を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中１０％ロバ血清および１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００からなるブロッキング溶液に室温で１時間浸漬した。一次抗体と二次抗体を、加湿チャンバー内で 4 °C で一晩、PBS 中の 1% Triton-X100 で希釈しました。 PBSで洗浄した後、組織を退色防止蛍光封入剤に封入し、カバースリップをかけた。実験で使用した一次抗体は、ウサギ抗ミオシン 7a (1:500 希釈) (Proteus Biosciences)、ヤギ抗 Sox2 (1:500 希釈) (Abcam)、およびマウス抗 YAP (1:50 希釈) (Santa) でした。クルーズ）。 HC束をファロイジン(1:500希釈)(Life Technologies)で標識し、神経線維をTuj1(1:500希釈)(Abcam)で標識し、核をDAPI(1:500希釈)(Sigma)で標識した。 FM1-43 取り込み実験は、FM1-43 膜染色の固定可能な類似体である FM1-43FX (1:500 希釈) (Invitrogen) を使用して実行されました。

マウスを麻酔した後、蝸牛を直ちに 4% パラホルムアルデヒドで灌流しました。次に、SEM 用に組織を 2.5% グルタルアルデヒドに浸漬しました。 SEM サンプルを 1% リン酸緩衝 OsO4 で後固定し、段階的エタノールシリーズで脱水し、乾燥させ、アルミニウムシート上にマウントし、金/パラジウムをスプレーしました。 SEM は ZEISS GeminiSEM 300 (ドイツ) を使用して実行されました。写真は疑似カラーで表示されます。

WT マウスのネイティブ HC と Mst1fl/fl/Mst2fl/fl で新たに生成された HC の機能を評価するため。 Sox9-CreERT2/+; Rosa26-tdTomato/+ マウスでは、切除したコルチ器官でパッチクランプ記録を実行しました。これらの電気生理学的実験では、P7 WT マウスまたはトランスジェニックマウスの蝸牛を DMEM/F12 で新たに解剖し、(mM) 135 NaCl、5.8 KCl、1.3 CaCl2、0.9 MgCl2、0.7 NaH2PO4・H2O、10 mM を含む細胞外溶液に浸しました。 HEPES、5.6 D-グルコース、2 Na-ピルビン酸(309 mOsm、NaOHでpHを7.40に調整)。次いで、蝸牛の頂端および中間回転をcell-TeK (Sigma)を用いてガラス上に固定化し、記録チャンバーに移した。記録のために、ランダムな天然 OHC、IHC 付近の SC、および心尖部の再生 HC が選択されました。

全細胞パッチクランプ記録は、Patchmaster ソフトウェア (HEKA Electronics) および EPC10/2 アンプ (HEKA Electronics、ランブレヒトファルツ、ドイツ) を使用して行われました。パッチピペットは、ホウケイ酸ガラスキャピラリー (Sutter) から引き出された 3 ～ 5 MΩ でした。ピペット充填溶液には以下が含まれていました (mM): 112 K-メタンスルホネート、20 KCl、10 HEPES、2 エチレングリコール四酢酸、10 Na-ホスホクレアチン、3 Mg-ATP、0.5 Na-GTP (285 mOsm、pH はKOHで7.40）。標本は、Nomarski 微分干渉コントラスト光学系 (60 倍の水浸対物レンズ) を備えた正立顕微鏡 (Olympus) で観察されました。

電圧クランプのために細胞を –80 mV に保持し、合計 K+ 電流の記録には、ステップあたり 10 mV で –120 mV から +50 mV までの電圧ステップを使用しました。実験は室温で行われ、測定された液間電位が 6 mV (K 内部) になるように電圧がオフラインで補正されました。

電気生理学データは、Igor ソフトウェア (Pro 6.22) および GraphPad Prism6 を使用して分析されました。 K+ 電流解析では、Rs が 20 MΩ 以下の場合にデータが受け入れられました。データは平均値±SEMとして報告されます。

以前の研究で報告されているように、6 ～ 8 個の培養蝸牛を収集し、AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit (QIAGEN) を使用して全 RNA を単離しました。

生のリードの予備処理は Casava 1.8 (Illumina) を使用して実行され、アダプターと低品質塩基は Trimmomatic (バージョン 0.23) を使用してトリミングされました。各サンプルのトリミングされたリードは、Hisat250 を使用してハツカネズミ UCSC mm10 ゲノムと位置合わせされました。 UCSC mm10 アノテーションに従って、アラインメントされたリードを HTseq (doi:10.1093/bioinformatics/btu638) でカウントしました。条件間の差次的発現分析は、DESeq2 R パッケージを使用して実行されました (Love et al., 2014)。調整された p 値 (padj) < 0.05 および倍率変化 > 1.5 を持つ遺伝子は、差次的に発現しているとみなされました。有意に差次的に発現された遺伝子のジーンオントロジー分析は、DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) を使用して行われました。ヒートマップの生成には Pheatmap R パッケージが使用されました。 Hippo、Notch、および Wnt シグナル伝達経路において差次的に発現される遺伝子のタンパク質間相互作用 (PPI) ネットワーク解析は、STRING ソフトウェアを使用して実行されました。

機能強化分析において。より潜在的に関与する経路を含めるために、誤検出率のカットオフ 0.1 が使用されました。

蝸牛の総タンパク質を、PMSF (Beyotime) を補充した RIPA (Beyotime) 溶解緩衝液を用いて単離した。タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイキット（Beyotime）を使用して測定し、タンパク質はBeyoGel™ Plus Precast PAGE Gel for Tris-Gly System（Beyotime）で分離し、ポリ二フッ化ビニリデン膜（Beyotime）に転写しました。メンブレンを、Tween 20 を含むトリス緩衝生理食塩水（TBST、50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl、および 0.1% Tween 20）中の 10% 脱脂粉乳で室温で 1 時間ブロックし、その後ブロッティングしました。一次抗体を用いて 4 °C で一晩反応させます。一次抗体は以下の通りであった：ウサギ抗Yap（1：1000希釈）（CST）、ウサギ抗ホスホYap（1：1000希釈）（Ser127）（CST）、ウサギ抗LATS1（1：1000希釈） (CST)、ウサギ抗リン酸 LATS1 (1:1000 希釈) (Thr1079) (CST)、ウサギ抗 Cyr61 (1:500 希釈) (Santa Cruz)、およびヤギ抗 CTGF (1:500 希釈) (サンタクルーズ）。すべてのブロットは同じ実験に由来しており、それらは並行して処理されました。

SP8 共焦点顕微鏡を使用して蛍光画像を取得しました。すべての画像にはラベルが付けられ、ImageJ、Adobe Photoshop CS6、および Illustrator CC を使用してデジタル処理されました。概略図は CDR ソフトウェアを使用して描画されました。蛍光画像内の細胞数の計測は、ImageJ を使用して実行されました。 HC、SC、EdU+ 細胞、および二重染色細胞の総数を、蝸牛の頂端、中間、および基底回転からの 200 μm 領域でカウントしました。

統計分析は、GraphPad Prism ソフトウェアを使用して実行されました。 2 つのグループを比較する場合は、1 サンプル t 検定と両側対応のないスチューデント t 検定を使用して統計的有意性を決定し、3 つ以上のグループを比較する場合は一元配置および二元配置分散分析を使用しました。 p < 0.05 の値は統計的に有意でした。データは平均値±SEMとして示されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。 RNA 配列解析データは、GEO 公開データベースリポジトリ (アクセッション番号 GSE213784) に保管されています。

Lasak, JM、Allen, P.、McVay, T.、Lewis, D. 難聴: 診断と管理。堅苦しい。 Care 41、19–31 (2014)。

論文 PubMed Google Scholar

Cunningham, LL & Tucci, DL 成人の難聴。Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 377、2465–2473 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

メイン州ウォーチョル脊椎動物の内耳における感覚再生: 細胞および種のレベルでの違い。解像度を聞いてください。 273、72–79 (2011)。

論文 PubMed Google Scholar

Bermingham-McDonogh, O. & Reh, TA 感覚受容体細胞の再生における調節された再プログラミング。ニューロン 71、389–405 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chai、R.ら。 Wnt シグナル伝達は、出生後のマウスの蝸牛において感覚前駆体の増殖を誘導します。手順国立アカデミー。科学。 USA 109、8167–8172 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, T. et al. Lgr5+ 細胞は、損傷した新生マウス卵形嚢における増殖と直接的な分化転換を介して有毛細胞を再生します。ナット。共通。 6、6613 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リー、W.ら。ノッチ阻害は、Wnt 経路の活性化を介して、哺乳動物の蝸牛において有糸分裂により生成された有毛細胞を誘導します。科学。見つかった。中国 112、19–19 (2015)。

Google スカラー

Bramhall, NF、Shi, F.、Arnold, K.、Hochedlinger, K. & Edge, ASB Lgr5 陽性支持細胞は、出生後の蝸牛で新しい有毛細胞を生成します。 Stem Cell Rep. 2、311–322 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Shi、F.、Kempfle、JS、および Edge、ASB Wnt 応答性 Lgr5 発現幹細胞は、蝸牛の有毛細胞前駆細胞です。 J. Neurosci. 32、9639–9648 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cafaro, J.、Lee, GS & Stone, JS Atoh1 の発現は、鳥類の有毛細胞の再生中に活性化された前駆細胞と分化している有毛細胞を定義します。開発者ディン。 236、156–170 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Shi、F.、Hu、L.、および Edge、ASB Lgr5 陽性蝸牛前駆細胞における β-カテニンの過剰発現による新生仔マウスにおける有毛細胞の生成。手順国立アカデミー。科学。 USA 110、13851–13856 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アトキンソン、PJ et al. Sox2 ハプロ不全は、マウス蝸牛の再生と Wnt 応答性を促進します。Ｊ．クリン．調査します。 128、1641–1656 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

コックス、BC et al. インビボでの新生児マウス蝸牛における自発的な有毛細胞の再生。開発 141、816–829 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, FX & Guan, K.-L. Hippo 経路: 規制当局と規制。遺伝子開発 27、355–371 (2013)。

Bao、Y.ら。 Hippo 経路の刺激因子をスクリーニングするための細胞ベースのアッセイにより、YAP 依存性遺伝子転写に対するドブタミンの阻害効果が明らかになりました。Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． 150、199–208 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Meng, Z.、Moroishi, T. & Guan, KL Hippo 経路制御のメカニズム。遺伝子開発 30、1–17 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu、FX & Guan、KL Hippo 経路: 規制当局と規制。遺伝子開発 27、355–371 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Strepkos, D.、Markouli, M.、Papavassiliou, KA、Papavassiliou, AG、Piperi, C. 脳腫瘍病理における YAP/TAZ 転写調節因子の新たな役割と標的化オプション。ニューロパトール。応用 Neurobiol.、https://doi.org/10.1111/nan.12762 (2021)。

Yu、FX、Zhao、B. & Guan、KL 臓器サイズ制御、組織恒常性、および癌における Hippo 経路。セル 163、811–828 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fu、V.、Plouffe、SW、Guan、KL 器官の発達、恒常性、および再生における Hippo 経路。カー。意見。セルバイオル。 49、99–107 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhang、ML、Sun、WH、Wu、HQ、Liu、ZD、および Wang、P。microRNA-103a-3p のノックダウンは、LATS1 を上方制御することにより Hippo シグナル伝達経路を介して甲状腺がん細胞の悪性化を阻害します。ネオプラズマ 67、1266–1278 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

AW ホン、Z 孟、KL グアン腸の再生と病気における Hippo 経路。ナット。胃腸ロール牧師。ヘパトール。 13、324–337 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gregorief, A.、Liu, Y.、Inanlou, MR、Khomchuk, Y. & Wrana, JL Lgr5(+) 幹細胞の Yap 依存性再プログラミングは腸の再生と癌を促進します。ネイチャー 526、715–718 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ロー、SLら。ゼブラフィッシュ yap1 は後側線の有毛細胞の分化に役割を果たします。科学。議員第 4 号、4289 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Gnedeva, K. et al. コルチ器官のサイズは、Yap/Tead を介した前駆細胞の自己複製によって支配されます。手順国立アカド。科学。米国 https://doi.org/10.1073/pnas.2000175117 (2020)。

マサチューセッツ州ルドルフら。 YAPはニワトリの平衡器官において有毛細胞の再生を仲介しますが、マウスではLATSキナーゼがその活性を抑制します。 J. Neurosci. 40、3915–3932 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Borse, V.、Barton, M.、Arndt, H.、Kaur, T. & Warchol, ME 発生中の損傷した卵形嚢におけるYAP1発現と細胞局在の動的パターン。科学。議員第 11 号、2140 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ファン、F.ら。キナーゼ MST1 および MST2 を薬理学的に標的にすることで、組織の修復と再生が強化されます。科学。翻訳。医学。 8、352ra108 (2016)。

論文 PubMed Google Scholar

Pan, N. et al. Pax2-Creを使用したAtoh1の条件付き欠失により、コルチ器官の大部分を失った分化した蝸牛有毛細胞を持たない生存可能なマウスが得られる。解像度を聞いてください。 275、66–80 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

チェン、Y.ら。出生後のマウス蝸牛における Gfi1、Pou4f3、および Atoh1 の共発現による成熟した機能的な有毛細胞の生成。 Cell Rep. 35、109016 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

コックス、BC et al. インビボでの新生児マウス蝸牛における自発的な有毛細胞の再生。開発 141、816–829 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

BY Park & Saint-Jeannet, JP 内耳の発達に対する Sox9 減少の長期的な影響。開発者ディン。 239、1102–1112 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Simmons, DD、Tong, B.、Schrader, AD & Hornak, AJ オンコモジュリンは、哺乳類の内耳のさまざまな有毛細胞タイプを識別します。 J.コンプ。ニューロール。 518、3785–3802 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Costa, A.、Powell, LM、Lowell, S. & Jarman, AP 感覚有毛細胞発達における Atoh1: 制約と補因子。セミン。セル開発バイオル。 65、60–68 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ni、W.ら。新生マウス蝸牛における生体内遺伝子再プログラミングによる細胞増殖と有糸分裂有毛細胞の生成を幅広くサポートします。 J. Neurosci. 36、8734–8745 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ma, S.、Meng, Z.、Chen, R.、Guan, KL カバ経路: 生物学と病態生理学。アンヌ。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． 88、577–604 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhang, S. et al. 新生マウス蝸牛におけるネオマイシン損傷後の Lgr5+ 前駆細胞トランスクリプトームの特性評価。フロント。モル。神経科学。 10、213 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gao, T. et al. Hippo シグナル伝達は、外分泌膵臓の分化と維持を制御します。消化器病学 144、1543–1553 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Varelas, X. 発生、恒常性、疾患における Hippo 経路のエフェクター TAZ と YAP。開発 141、1614–1626 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Pefani, DE & O'Neill, E. Hippo 経路と DNA 損傷に応答したゲノム安定性の保護。 FEBS J. 283、1392–1403 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

林 S.、横山 H. & 田村 K. 臓器再生のサイズ制御における Hippo シグナル伝達経路の役割。開発者成長が違う。 57、341–351 (2015)。

論文 PubMed Google Scholar

Patel, SH、Camargo, FD & Yimlamai, D. 肝臓における Hippo シグナル伝達は、器官のサイズ、細胞運命、および発がんを調節します。消化器病学 152、533–545 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wang, C. et al. 再生肝臓癌および肝細胞癌における Yes 関連タンパク質および mRNA レベルの違い。モル。 Med Rep. 5、410–414 (2012)。

CAS PubMed Google Scholar

グリハルバ、JL et al. 肝臓再生中の Hippo シグナル伝達経路と YAP 活性化の動的変化。午前。Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．胃腸検査。肝臓生理学。 307、G196–G204 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bai, H. et al. Yes 関連タンパク質は、胆管結紮後の肝臓の反応を調節します。肝臓学 56、1097–1107 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

フォン・ギーズ、A.ら。 Hippo シグナル伝達の核標的である YAP1 は、心筋細胞の増殖を通じて心臓の成長を刺激しますが、肥大は刺激しません。手順国立アカデミー。科学。 USA 109、2394–2399 (2012)。

記事 Google Scholar

グリュンドル、M.ら。 YAP と Myb-MuvB (MMB) 複合体との相互作用は、心筋細胞の増殖を促進する転写プログラムを定義します。 PLoS ジュネット。 16、e1008818 (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, B.、Tumaneng, K. & Guan, KL 器官サイズ制御、組織再生および幹細胞自己再生における Hippo 経路。ナット。セルバイオル。 13、877–883 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gnedeva, K.、Jacobo, A.、Salvi, JD、Petelski, AA & Hudspeth, AJ 弾性力はマウス卵形嚢の成長を制限します。 Elife 6、https://doi.org/10.7554/eLife.25681 (2017)。

Scheibinger, M.、Ellwanger, DC、Corrales, CE、Stone, JS & Heller, S. ニワトリ卵形嚢におけるアミノグリコシド損傷と有毛細胞の再生。 J. Assoc. レス耳鼻咽喉科。 19、17–29 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Lush, ME & Piotrowski, T. ゼブラフィッシュ側線における感覚有毛細胞の再生。開発者ディン。 243、1187–1202 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

東太郎、A. 他 YAP/TAZは細胞の仕組みをNotchシグナル伝達に結びつけ、表皮幹細胞の運命を制御します。ナット。共通。 8、15206 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アゾリン、L.ら。 Wntシグナル伝達のメディエーターとしてのTAZの役割。セル 151、1443 ～ 1456 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アゾリン、L.ら。 β-カテニン破壊複合体へのYAP/TAZの取り込みは、Wnt応答を調整します。セル 158、157–170 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Totaro, A.、Panciera, T. & Piccolo, S. YAP/TAZ アップストリーム信号とダウンストリーム応答。ナット。セルバイオル。 20、888–899 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Totaro, A.、Castellan, M.、Di Biagio, D. & Piccolo, S. YAP/TAZ とノッチシグナリング間のクロストーク。トレンドセルバイオ。 28、560–573 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

この研究は、中国国家重点研究開発プログラム (番号 2017YFA0103900)、中国国家自然科学財団 (番号 82192860、81830029、81900931、81970879)、上海国家自然科学財団 (21ZR1411800) からの助成金によって支援されました。優秀医師・優秀臨床研究者プログラム（番号SYB202008、SZA202002）、「セーリングプログラム」（19YF1406000）、上海市衛生委員会の研究プロジェクト（2020YJZX0110、2022XD059）。

Xiaoling Lu、Huiqian Yu、Jiaoyao Ma、Kunkun Wang の著者も同様に貢献しました。

耳鼻咽喉科研究所および耳鼻咽喉科、眼科および耳鼻咽喉科病院、国家医療神経生物学重点研究所およびMOEフロンティア脳科学センター、NHC聴覚医学重点研究所（復旦大学）、復丹大学、200031、上海、中国

Xiaoling Lu、Huiqian Yu、Jiaoyao Ma、Kunkun Wang、Luo Guo、Yanping Zhang、Huawei Li、Shan Sun

厦門大学生命科学部、361100、アモイ、中国

ボアン・リー＆ゼハン・チャオ

復旦大学生物医科学研究所、200032、上海、中国

ファーウェイ・リー

脳科学研究所および脳科学共同イノベーションセンター、復旦大学、200032、上海、中国

ファーウェイ・リー

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

HL と SS が研究を計画しました。 XL、HY、KW、JM、YZ が実験を実施しました。 XL、KW、および HY がデータを取得しました。 XL、HY、LG、SS がデータを分析しました。 HL が試薬を提供しました。 XL、HY、SS が原稿を書きました。 XL、HY、JM、および KW は、この作業に等しく貢献しました。

Huiqian Yu、Huawei Li、または Shan Sun への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Lu、X.、Yu、H.、Ma、J. 他 Mst1/2 活性の喪失は、新生児コルチ器官における非有糸分裂有毛細胞の生成を促進します。 npj Regen Med 7、64 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41536-022-00261-4

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 1 月 17 日

受理日: 2022 年 10 月 10 日

公開日: 2022 年 10 月 25 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41536-022-00261-4

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

前: シャニール・ミュア、ヘアケア会社サロンの立ち上げに先立って婚約者に感謝次: セフォラ、新 CCO とラテン系ルーツの祭典: ババリベラが儀式でヘアケア帝国を築く

お問い合わせを送信

送信