発生過程におけるマウス前庭毛束のプロテオーム

Jul 17, 2023

Scientific Data volume 2、記事番号: 150047 (2015) この記事を引用

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メトリクスの詳細

脊椎動物の毛束の発生は、正確に組織化された出来事であり、最終的にはアクチンに富んだ不動毛と単一の軸索キノシリウムの緊密に配列された配列が生成されます。 バンドルのタンパク質組成が発生中にどのように変化するかを理解するために、ツイストオフ法を使用して若いマウス（生後 P4 ～ P6）および成熟したマウス卵形嚢（P21 ～ P25）からバンドルを単離し、液体クロマトグラフィーを使用してそれらの構成タンパク質の特性を調べました。データに依存した収集を行うタンデム質量分析。 MaxQuant とラベルフリー定量を使用して、両方のバンドルと卵形嚢全体のタンパク質の相対存在量を測定しました。 2 つの画分の間のタンパク質存在量を比較することで、バンドルの濃縮度を計算できます。 これらのデータは、識別子 PXD002167 で ProteomeXchange 経由で入手でき、哺乳動物の前庭束に存在するタンパク質と、その濃度が発生中にどのように変化するかを調べるのに役立ちます。

デザインタイプ

並列グループ設計・複製設計・生物発生設計

測定タイプ

タンパク質発現プロファイリング

テクノロジーの種類

質量分析アッセイ

因子の種類

ライフサイクルステージ

サンプルの特性

ハツカネズミ・膜迷路の卵形嚢

報告されたデータを説明するマシンがアクセス可能なメタデータ ファイル (ISA-Tab 形式)

内耳の感覚器官である脊椎動物の毛束は、音や頭の動きなどの機械的信号を神経系の電気的興奮に変換するプロセスである機械伝達に必要です。 感覚有毛細胞の頂端面から突き出たこの束は、数十から数百のアクチンで満たされた不動毛と、単一の真の軸索繊毛であるキノシリウムで構成されています1。 バンドルの機能と組み立て方を理解するには、バンドルの構成に関する知識が必要です。 質量分析法は、タンパク質組成を特徴付けるための最良のハイスループットな方法として浮上しています。 私たちはニワトリ前庭毛束 2 のプロテオームについて優れた理解を持っており、さらにニワトリ蝸牛束 3 についてより限定的な見解を持っていますが、マウス毛束のタンパク質組成の決定は次の重要なステップです。 マウスの内耳は、人間の難聴や平衡感覚障害を研究するための優れたモデルであるだけでなく、マウスで利用できる多くの遺伝的および分子的ツールにより、他の生物では実行できない多くの実験が可能になります。 さらに、発生中にバンドルのタンパク質組成がどのように変化するかについてはほとんどわかっていません。 たとえば、不動毛の伸長における重要なステップを制御するタンパク質は、若い束でのみ見つかる可能性があります。

毛束が少ない。 各聴覚器官または前庭器官には有毛細胞が数千個しかなく、ニワトリ (およびマウス; 以下を参照) では、有毛細胞の束が器官内の総タンパク質の 1% 未満を占めます 2。 1 匹のマウス卵形嚢のバンドル中にはわずか約 2 ng のアクチンが存在し4、アクチンはバンドルタンパク質全体の >50% を占めます (以下を参照)。 さらに、不動毛の最も興味深い分子の多くは、アクチンのモル存在量の 10-5 未満、つまり耳あたり 1 アトモル未満で存在します。 したがって、バンドルのプロテオームを特徴付けるための生化学実験には、広範な解剖、特殊な精製方法、高感度の検出方法の使用が必要です。

タンパク質質量分析法は、毛束からの広範囲のタンパク質を分析するための感度とダイナミックレンジを備えた唯一の技術として浮上しました。 トップダウン 5 およびデータに依存しない 6 タンパク質分析法は、将来的にはバンドルタンパク質の分析に十分に発展すると思われますが、現時点では、データ依存性のショットガン質量分析法 7 が、低濃度および高濃度の両方の検出を可能にする十分に特徴付けられたアプローチを提供します。ただし、最終的には質量分析計のダイナミックレンジによって制限されます。 さらに、質量分析データを使用してタンパク質を定量する方法が改善され、親イオンまたは娘イオンの強度を使用して相対的なタンパク質存在量を正確に測定できるようになりました 8,9。 これらの技術を組み合わせることで、毛束のプロテオームの徹底的な特性評価が可能になります。

我々は、アガロースゲルのマトリックス内で毛束を捕捉するツイストオフ毛束精製技術10を使用して、前庭器官の1つである卵形嚢からマウス毛束を単離しました（図1a、b）。 それぞれ 100 個の耳から採取したバンドルの 4 つの生物学的複製を、未熟マウス (~P5) および若年成体 (~P23) マウスから収集しました。 精製したバンドルタンパク質を、Orbitrap 質量分析計を使用して液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析 (LC-MS/MS) に供しました。 束の濃縮を調べるための参照を提供するために、同じ 2 つの発育段階のそれぞれで 10 匹のマウス卵形嚢の 4 つの生物学的複製も分析しました。 私たちは、Andromeda 検索エンジンでタンパク質を同定し、前駆体ペプチド強度のラベルフリー測定を使用してそれらを定量しました。 毛束と卵形嚢の両方で同定された各タンパク質の相対的な存在量を比較することにより、毛束におけるタンパク質の濃縮度を決定することができました。

(a) 感覚パッチがマークされたマウス内耳のペイントフィル (「utr」、卵形嚢、「a」、半規管膨大部、「sac」、球形、「coch」、蝸牛)。 参考文献の図 1b から改変。 許可を得て22。 （b）卵形嚢上皮の約50×50μm領域（約3,000個のうち約100個の有毛細胞）のファロイジン染色（アクチンを検出するため）。 毛嚢が卵形感覚上皮から立ち上がっているのが見られ、各細胞を取り囲む円周状のアクチンベルトが特徴です。 (c) ワークフロー。 P5 束 (BUN)、P23 束、P5 卵形嚢 (UTR)、および P23 卵形嚢のそれぞれ 4 つの生物学的複製を調製しました。 束のサンプルのうち、タンパク質の約 10% は卵形嚢に由来します。 バンドルは卵形嚢サンプル中のタンパク質の 1% 未満を構成します。 16 個のサンプルのそれぞれのタンパク質を短い SDS-PAGE 実行を使用して分離し、レーンをそれぞれ 6 つの部分に切断しました。 サンプルは、LC-MS/MS の前に還元、アルキル化され、トリプシン消化を受けました。 このプロジェクトでは、合計 96 回の LC-MS/MS 実行が実行されました。 各実行からのペプチドは MaxQuant を使用して同定されました。 タンパク質ごとに 6 つのゲル スライスからのデータを再度結合して、最終出力が単一の生物学的複製から検出されたすべてのペプチドを表すようにしました。 MaxQuant は、固有のペプチドによって区別されないすべてのタンパク質をグループ化しました。 追加のグループ化により、ペプチドの少なくとも 20% を共有するすべてのタンパク質がまとめられました。 (d) 精製されたマウス卵形嚢毛束をファロイジンで染色してアクチン (マゼンタ) を検出し、DAPI で染色して核 (緑色) を検出します。 細胞が実質的に汚染されている束と領域の両方を解剖顕微鏡で見ることができ、汚染領域を束から切り取ることができます。 示されている準備では、切除される領域が破線で示されています。 いくらかの核汚染が残ることに注意してください（矢印）。 (e) マウスバンドル調製物中の汚染を推定するために使用されるタンパク質イムノブロット。 示された数の耳相当の束 (左) または卵胞上皮 (右) を実行しました。 上のパネルはタンパク質転写後のブロットの墨汁染色です。 バンドルレーン内のアクチンおよび汚染ケラチンに対応するバンドに注目してください。 下の 2 つのパネルはタンパク質イムノブロットです。 15 耳分の材料を使用した場合でも、原形質膜マーカー Na+/K+-ATPase および中間径フィラメントタンパク質ビメンチンはバンドル調製物中に検出されませんでした。

生後 4 ～ 6 日のマウス (「P5」と呼ばれる) および P21 ～ P25 卵形嚢 (「P23」) の精製マウス毛束、および同年齢の卵形嚢を含む 4 セットのサンプルを収集しました (表 1)。 ）。 バンドル サンプルは「BUN」と呼ばれます。 それらは細胞体によって中程度に汚染されています。 卵形嚢サンプルは「UTR」と呼ばれます。 総タンパク質の1％未満ではありますが、毛束も含まれています（補足図1）。 4 つの生物学的複製を 4 つの条件のそれぞれについて調製しました。 タンパク質はSDS-PAGEで部分的に分離され、その後ペプチドに消化されました。 LC-MS/MS を使用して、4 つの条件からペプチドを同定および定量しました。 私たちは、アンドロメダ検索エンジン 11 が組み込まれた MaxQuant8 を使用して、ペプチドをマウスタンパク質データベースのエントリと照合し、ペプチドをタンパク質に組み立て、それらのタンパク質を定量しました。 バンドルの分離、サンプル前処理、質量分析、およびデータ分析のワークフローを図 1c に示します。 質量分析計の機器設定、データベース検索、ペプチドからタンパク質へのマッピング、および定量（プロテオミクス実験に関する最小限の情報 [MIAPE] 要件を満たす）に関する情報を補足表 1 に示します。

毛束はツイストオフ法 2,4,10,13,14 を使用して精製されました。 メソッドについては参考文献で詳しく説明されています。 14. P4〜P6（発達中の卵形嚢）またはP21〜P25（若年成体）のCD-1マウスから卵形嚢斑を解剖した。 マウスの卵形嚢を解剖する方法は他の場所で紹介されています15、16。 黄斑は、フェノールレッドを含まないリーボビッツのＬ－１５培地（２１０８３－０２７；Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で３５ｍｍプラスチック皿（ＥＡＳＹ ＧＲＩＰ Ｆａｌｃｏｎペトリ皿；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の未処理の底に付着した。 耳石膜はまつげで除去されました。 プラスチック製のワッシャーを皿上の黄斑の周囲に置き、標本に 42 °C の 4.5% 低融点アガロース (5 μm フィルターで濾過) を注ぎました。 アガロースを 4 °C で固いゲルに固定し、リングによって形成されたアガロースのディスクを解剖顕微鏡下の灌流プラットフォーム上に置きました。 L15 の一定流下では、黄斑が除去され、アガロースに詰まった毛束が残されました。 小さなメスまたはタングステン針を使用して明らかな細胞破片を除去し（図1b）、次に単一の卵形嚢からの束を最小体積（<0.5μl）のアガロースプラグで取り出しました。 アガロース中に単離した束を、低タンパク質結合微量遠心分離管中で-80℃で凍結した。 バンドルサンプルは、後に質量分析分析のためにプールされました。

卵形嚢斑全体の分析のために、卵形嚢を解剖して感覚上皮領域の外側のすべての組織を除去し、耳石膜を除去した。 基底膜と結合組織から感覚上皮を剥がした以前のニワトリ卵形嚢の分析 2,17 とは異なり、ここでは剥がされていないマウスの卵形嚢全体を分析しました。 マウス卵形嚢感覚上皮は、プロテアーゼ処理（例えば、コラゲナーゼまたはサーモリシン）なしでは間質から容易には剥がれません。 したがって、有毛細胞および支持細胞タンパク質に加えて、調製物には細胞外マトリックス、間質および神経由来のタンパク質が含まれていた。

蛍光顕微鏡で単離された毛束を検査するために、洗浄された単離された毛束を含むアガロースディスクを、12ウェルプレート内のL15培地で洗浄した。 次いで、アガロースディスクをＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドに移し、室温で２０分間インキュベートした。 PBS で 2 回洗浄した後、ディスクを 4 °C で一晩保管しました。 翌日、バンドルを PBS 中の 0.5% Triton X-100 で 10 分間透過処理し、その後 13 nM (6.6 μM ストックの 1:500) Alexa Fluor 488 ファロイジン (Life Technologies) および 1:10,000 DAPI (Sigma) に移しました。 ) PBS 中で 2 ～ 3 時間放置します。 ディスクをＰＢＳ中で３回リンスし、次いでアガロース中の束をディスクから取り出して薄いスラブとした。 スライド上に置いた後、サンプルを VECTASHIELD 封入剤 (Vector Laboratories) でコーティングし、カバースリップで覆いました。

イムノブロッティングの特徴付けのために、質量分析実験で説明したように、マウスの毛束と卵形嚢を P21 ～ 25 マウスから収集しました。 バンドルおよび卵形嚢タンパク質を還元性 NuPAGE LDS サンプルバッファー (Invitrogen) で可溶化しました。 サンプルを 65 °C で 15 分間、次に 95 °C で 5 分間加熱し、NuPAGE 4 ～ 12% Bis-Tris ゲル (1.5 mm x 10 ウェル; Invitrogen) に流すことによって分離しました。 標準手順に従って、タンパク質を PVDF 膜 (Millipore) に転写しました。 膜を水およびＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）でリンスし、次いで、ＰＢＳＴで１：５，０００に希釈したブラックインディアンインク（Ｗｉｎｄｓｏｒ ＆ Ｎｅｗｔｏｎ）で３０分間染色した。 次に、膜をAmersham ECLプライムブロッキング試薬（GE Healthcare）で1時間ブロックし、Developmental Studies Hybridoma Bankからの一次抗体（抗ビメンチン、#AMF-17b; ATPase、抗Na(+ ) K(+) アルファ サブユニット、#a5) をブロッキング試薬で 1:1,000 に希釈しました。 ＰＢＳＴ中で５×６分間洗浄した後、膜を、ブロッキング試薬で１：１０，０００に希釈した二次抗体（ヤギ抗ウサギＨＲＰおよびヤギ抗マウスＨＲＰ）中で室温で１時間インキュベートした。 バンドは、SuperSignal Pico West ECL 試薬 (Thermo Scientific) を使用して視覚化しました。

バンドル単離に使用したアガロースから干渉ポリマーを除去するために、還元、アルキル化、トリプシン消化の前に短い SDS-PAGE を実行してタンパク質を分離しました 2,18。 卵形嚢タンパク質も SDS-PAGE によって分離されました。 サンプルを調製するために、50 mM ジチオスレイトールを含む 1.2x NuPAGE LDS サンプル バッファー (Invitrogen) を、100 卵形嚢相当のバンドルあたり合計最終容量 40 ～ 60 μl になるように添加しました。 体積は、束を切り出したアガロースの量に応じてサンプルごとに異なります。 卵形嚢タンパク質も、NuPAGE LDS サンプルバッファー (10 卵形嚢あたり 40 μl) で可溶化しました。 サンプルを 65 °C で 15 分間加熱し、次に 95 °C で 5 分間加熱しました。 NuPAGE 4-12% Bis-Tris ゲル (1.5 mm x 10 ウェル; Invitrogen) に約 1 cm 流し込み、タンパク質を分離しました。 1 つのレーンは 50 μl 未満のサンプルに使用され、2 つのレーンは 50 μl を超えるサンプルに使用されました。 ゲルを水ですすぎ、次いで室温でImperial Protein Stain (Thermo Scientific)を用いて5時間染色した。 4 °C の水で 5 時間洗浄した後、分離されたタンパク質を含む 1 cm のゲルを手動で 6 片にスライスし、それぞれを次のステップで別々に処理しました。

ゲル片をシリコン処理したチューブに移し、その後、200μlのHPLCグレードの水(30秒間ボルテックス)、200μlの50% 50mM NH4HCO3/50% MeOH(1分間ボルテックス)、200μlの50% 50mM NH4HCO3で洗浄した。 /50% アセトニトリル (5 分間ボルテックス)、および 200 μl の 100% アセトニトリル (30 秒ボルテックス)。 残りの溶液を除去し、ゲル片をSpeedVac真空濃縮器で短時間乾燥させた。 それらを-20℃で一晩保管した。

ゲル片を、50mM NH4HCO3中の新たに作製した25mM DTT 100μlで再水和し、次いで56℃で20分間インキュベートした。 上清を廃棄し、50mM NH4HCO3中の55mMヨードアセトアミド100μlを加えた。 この溶液をゲル片とともに暗所、室温で２０分間インキュベートした。 上清を廃棄し、ゲル片を400μlのHPLCグレードの水で2回洗浄した。 洗浄液を廃棄し、200μlの50% 50mM NH4HCO3/50% アセトニトリルを加えた(5分間ボルテックス)。 この洗浄液を廃棄し、200μlの100%アセトニトリルを加えた(1分間ボルテックス)。 上清を廃棄し、サンプルを SpeedVac で 2 ～ 3 分間乾燥させました。

私たちは、ProteaseMAX Surfactant-Trypsin Enhancer (Promega) での消化により、毛束ペプチドの回収が大幅に増加することを発見しました。 ProteaseMAX の 1% 溶液は、100 μl の 50 mM NH4HCO3 をストックアリコートに旋回させながら加えて混合することによって調製しました。 この ProteaseMAX 溶液を氷上に保管しました。 15μlの1％ProteaseMAXを1485μlの50mM NH4HCO3に添加することにより、0.01％ProteaseMAXの1.5mlアリコートを調製した。 15 μl 1% ProteaseMAX を 1440 μl の 50 mM NH4HCO3 に添加することにより、0.01% ProteaseMAX/6 ng μl-1 トリプシンの 1.5 ml アリコートを作成しました。 溶液を混合し、次いで新たに50 mM NH4HCO3で希釈した200 ng μl-1 トリプシンストック(Sigma-Aldrich T6567 プロテオミクスグレード、ブタ膵臓由来、ジメチル化) 45 μlを加えた。 各ゲル片に、0.01% ProteaseMAX/6 ng μl-1 トリプシン溶液 30 μl を加え、4 °C で 30 分間インキュベートしました。 ゲル片を２０μｌの０．０１％ＰｒｏｔｅａｓｅＭＡＸ溶液で覆い、完全に浸漬した状態を維持した。 トリプシン消化を 37 °C で 3 時間進行させました。

消化溶液を新しいチューブに移し（各チューブから 25 ～ 40 μl の液体）、元のゲル片が分割されている場合はサンプルを合わせました。 ３０μｌの２．５％トリフルオロ酢酸（ＨＰＬＣグレードの水中）をゲル片に添加した（１５分間ボルテックス）。 溶液を除去し、最初の消化溶液と混合した。 溶液をボルテックスし、次いで合わせた溶液を微量遠心分離機で14,000 rpmで10分間遠心分離した。 上清を0.45μmフィルターチューブ(Millipore Ultrafree遠心フィルター、#UFC0HV00)に移した。 サンプルは 4,000 rpm で 5 分間回転させました。すべてのサンプルは、実質的にすべての溶液が蒸発するまで（約 2 時間）SpeedVac で乾燥させ、質量分析前に -80 °C で保管しました。

1 回の実験に相当する毛束または卵形嚢を、6 つのゲル片に対応する 6 回の LC-MS/MS 実行を使用して分析しました。 LC-MS/MS システムは、Thermo Electron Orbitrap Velos ETD 質量分析計と、Phenomenex C18 が自己充填された長さ 8 cm x 内径 75 μm の逆相キャピラリー カラムに接続された Protana ナノスプレー イオン源で構成されました。粒径10μmのジュピター。 サンプルを 15 μl の 50% アセトニトリル/5% ギ酸で処理しました。 7.5μlを注入し、流速0.5μl min-1で1.2時間かけてアセトニトリル/0.1M酢酸勾配によりカラムからペプチドを溶出した。 ナノスプレー イオン源は 2.5 kV で動作しました。 消化物は、機器のデータ依存機能を使用して分析され、連続スキャンで取得されました (1) Orbitrap 検出器で 60,000 分解能の単一のフルスキャン質量スペクトルを取得して、ペプチドの m/z と強度を決定します、(2) 20 の生成物イオン トラップ内のイオン スペクトル。これにより、ペプチドをデータベースと照合することができます。

タンパク質の同定と定量には、MaxQuant バージョン 1.5.1.2 ソフトウェアを使用しました8。 MaxQuant ダウンロードに関連付けられたデフォルトの汚染物質ファイルは、毛束に存在することがわかっているエントリ (アクチンなど) を削除し、毛束精製ワークフローに入る不純物 (ケラチン、ヘモグロビンなど) を追加するように編集されました。 質量分析データは、Andromeda11 を使用して Ensembl バージョン GRCm38_71 (2013 年 4 月リリース) に対して検索されました。 Ensembl FASTA ファイルには、最近決定された Xirp2 代替スプライス プロダクトが追加されました19。 「実行間の一致」は使用されませんでした。 タンパク質の同定は、誤発見率 (FDR) 1% で報告されました。

MaxQuant を使用して、タンパク質存在量の尺度である iBAQ を計算しました。 iBAQ 値は、タンパク質強度を理論的に観察可能な 6 ～ 30 アミノ酸のトリプシンペプチドの数で割ることによって得られ 20、平均してタンパク質存在量と高い相関関係があります 9,20。

MaxQuant の「proteinGroups.txt」ファイルをさらに処理する Mathematica バージョン 10 プログラムを作成しました。 このプログラムは、(1) デフォルトのタンパク質名と記号をユーザー定義のエントリに置き換え、(2) MaxQuant によって「潜在的な汚染物質」または「リバース」としてマークされたすべてのエントリを削除しました (「部位によってのみ識別される」とラベル付けされたタンパク質は保持されました)。 3) ペプチドの > 20% を共有するタンパク質をグループ化し、(4) 出力ファイルを準備しました。

出力ファイルを Excel にインポートし、そこで (5) 相対 iBAQ (riBAQ)2,9 を計算しました。これは、タンパク質またはタンパク質グループの iBAQ (MaxQuant によって計算) を、すべての非汚染物質、非反転 iBAQ 値で割った値です。反復実験について、(6) 各実験条件で平均値と標準偏差を決定、(7) 決定された束対卵形嚢比を各発達年齢ごとに計算、(8) 束と卵形嚢の P5 対 P23 比を計算。

MaxQuant の出力を取得し、関連するタンパク質をグループ化するカスタム Mathematica コードは、ProteomeXchange データセット (PXD002167) で入手できます。

以下に説明するすべてのデータおよび分析ファイルは、ProteomeXchange リポジトリ (アクセッション番号 PXD002167; http://www.proteomexchange.org) に保管されています。 このデータセットには 96 個の RAW ファイルが含まれており、4 つの実験条件 (P5 バンドル、P5 卵形嚢、P23 バンドル、P23 卵形嚢) すべてからの LC-MS/MS データを表し、ゲル スライスごとに 1 つずつ、6 回の実行で分析された 4 つの生物学的複製によって表されます (データ)引用1）。 このデータセットには、「txt」フォルダー内のすべての MaxQuant ファイルを含む「SEARCH_MAXQUANT.zip」と、MaxQuant によるファイルの検索方法を指定する「experimentalDesignTemplate.txt」ファイルも含まれています (データ引用 1)。 。 MaxQuant検索に使用されるFASTAファイルは'OTHER_FASTA.zip'(データ引用1)として含まれており、Mathematicaプログラム、入力ファイル、および出力は'OTHER_MATHEMATICA.zip'(データ引用1)として一緒に配置されています。 最後に、データの再分析に興味のない読者にとって最も重要なファイルは、データ レコード内で「OTHER_EXCEL_FINAL.zip」として圧縮された「S1 Mouse P4-P21 data Orbitrap-MaxQuant 2015-05-29c.xls」です (データ引用 1)。 ; これは、各実験条件下での各タンパク質の平均データを含む Excel ファイルです。 この表は、補足表 2 としてここに複製されます。

毛束データセットの有用性は、細胞体からの汚染によって生じた毛束サンプルに存在するタンパク質を無視できるかどうかにかかっています。 解剖が完璧であることはほとんどありません。 損傷した組織の一部は、解剖顕微鏡と暗視野照明を使用して各標本を検査した後に除去できます。 その後、最もひどい、明らかな汚染を解剖して取り除くことができます (図 1d)。 それにもかかわらず、単離された毛束サンプルには、毛束には存在しないことが知られている構造、例えば核やミトコンドリアからのタンパク質が依然としてかなりのレベルで含まれている。

毛束と卵形嚢の両方におけるヒストンの相対存在量を測定することにより、毛束調製物の純度を評価します (表 2)。 核タンパク質はバンドルに存在しないはずだからです。 ヒストンの BUN/UTR 比は、BUN に存在する卵形嚢由来のタンパク質の割合を表します。 4/4 BUN 実行および 4/4 UTR 実行で検出されたヒストン エントリーを使用して、P5 BUN サンプルは約 97% のバンドルであり、P23 BUN サンプルは約 84% のバンドルであることが判明しました。 2 つの年齢の濃縮値 (0.033±0.027 および 0.16±0.10) を使用して、これらのバックグラウンド レベルを超えるバンドル内のタンパク質の有意な濃縮を統計的にテストできます。

さらに、毛束に存在しないことが知られているタンパク質に対する抗体を使用して毛束サンプルの免疫ブロットを実行することによって、純度も評価しました（図1e）。 P23 サンプルを使用すると、Na+/K+-ATPase およびビメンチンのバンドルシグナルは、これらのアッセイでの検出限界を下回りました。 ただし、これらは質量分析法で分析したものとは別の調製物でした。 P5 および P23 質量分析データのヒストン分析は、これらの調製物中の汚染を評価するのにより適切です。

4 つの生物学的複製を 4 つの条件 (P5 BUN および UTR、P23 BUN および UTR) に対して使用しました。 16 個のサンプルそれぞれの riBAQ 値の分布を示す箱ひげ図を図 2a に示します。 すべてのサンプルをペアごとに比較した行列散布図を図 2b に示します。 生物学的複製サンプルが最も高いピアソン相関係数を示したことに注目してください (ボックス内の数値)。 同様に、主成分分析により、4 セットのサンプルのそれぞれが互いに明確に区別されることが示されました (図 2c、d)。 差異の 90% 以上が PC1 によって占められていました。 束サンプルは PC2 で最大の分離を示し、卵形嚢サンプルは PC3 で最大の分離を示しました。 図 2 の結果を総合すると、各実験条件の反復が十分に類似しており、組み合わせることができることがわかります。

(a) 示されたサンプル中のすべてのタンパク質の riBAQ 値を示す箱ひげ図。 (b) 2 つのサンプルのそれぞれで検出されたタンパク質のペアごとの比較を示す行列散布図。 赤い線、データの LOESS 平滑化。 対角線の右側/上の数字はピアソン相関係数の絶対値です。 生物学的複製 (色付きの背景) の相関が高いことに注目してください。 (c、d) 16 サンプルすべての主成分分析。 (c) では、PC1 (分散の 91%) が PC2 (分散の 5%) に対してプロットされています。 (d) では、PC2 が PC3 に対してプロットされています (分散の 2%)。

各年齢における束および上皮で同定されたタンパク質の数を図3aに示します。 卵形嚢タンパク質のriBAQ値の分布は、P23と比較してP5で非常に類似していました（図3b）。 各タンパク質のlog P5/P23比の分布は0付近に集中しており、大部分のタンパク質はP5とP23の間で発現レベルがほとんど変化していないことを示しています（図3c）。 同定されたタンパク質の数が少ないことを反映して、バンドルタンパク質riBAQタンパク質の分布の振幅は減少し、より豊富なタンパク質へのシフトであるように見えました（図3d）。これは、タンパク質のみが0.45でバンドルに富んでいた場合に最も明白でした。以上のレベルがプロットされました（図3e）。 バンドルで検出されたほとんどのタンパク質は、P5 よりも P23 でより豊富でした (図 3f)。 これらのデータを総合すると、P5 では少数の豊富なタンパク質がバンドル サンプルを支配しており、発生中にバンドル プロテオームがより複雑になったことを示唆しています。

(a) バンドルおよび卵形嚢サンプルで同定されたタンパク質またはタンパク質グループの数を示すベン図。 少数のタンパク質はバンドルでのみ同定されました。 (b) 卵形嚢サンプルの平均タンパク質 riBAQ 値の log10 の分布。 3 つ以上のサンプルから検出されたタンパク質のみが含まれていました。 (c) P5 および P23 における各卵形嚢タンパク質の riBAQ 値の分布。 フィットは単一ガウスです (+0.2 でピーク)。 (d) 束サンプルの不動毛値ごとの平均タンパク質分子の log10 の分布。 riBAQ 値は、riBAQ がタンパク質の存在量を正確に測定し、アクチンが不動菌 1 つあたり 400,000 分子で存在すると仮定して、不動菌 1 つあたりの分子に変換されました 2,9。 3 つ以上のサンプルから検出されたタンパク質のみが含まれていました。 (e) BUN/UTR 濃縮度が 0.45 以上のタンパク質のみが含まれたことを除き、(d) と同じ。 (f) P5 および P23 における各バンドルタンパク質の riBAQ 値の分布。 フィットは単一ガウスです (-0.6 でピーク)。 (g) 総タンパク質の代用としての総 iBAQ 値。 汚染物質と逆エントリは最初に除去されました。 P5 および P23 卵形嚢サンプルは類似していましたが、P23 束サンプルでは P5 と比較して 1.7 倍多くの iBAQ シグナルがありました。

上で述べたように、P5およびP23卵形嚢では同様の数のタンパク質が同定されましたが、P5バンドルではP23バンドルの半分未満のタンパク質が同定されました（図3a）。 P5では、P23よりも卵形嚢有毛細胞が少なく（参考文献21）、これは総iBAQシグナルにも反映されています（汚染物質と逆一致を除く）。 P5よりもP23のバンドルにはほぼ2倍多くのiBAQシグナルがありました（図3g）。

MaxQuant の組み込み Andromeda 検索エンジンを使用して MS2 スペクトルをデータベースのペプチドと照合する必要があり、タンパク質は MS1 強度プロファイルに基づいて定量されます。 .RAW ファイルの MaxQuant 分析にはデフォルト設定を使用する必要がありますが、iBAQ 定量オプションをオンにする必要があります。

私たちは、'proteinGroups.txt' MaxQuant 出力ファイルをさらに処理する Mathematica (バージョン 10.1.0.0) プログラムを作成しました。 プログラムには 2 つのバージョンが提供されています。 「MaxQuant 1.2.2.5 マウス 2013-12-19.nb」は、このプロジェクトのデータ分析に使用されたバージョンですが、「MaxQuant 1.4.1.2 2015-02-25.nb」は、MaxQuant のより新しいバージョン用に再設計されたものです。より堅牢に。 このプログラムは次の手順を実行します。

(1) タンパク質の名前と記号を置き換えます。 各識別子に関連付けられたタンパク質の説明と記号を含むユーザー ファイル (「Mouse abbrv table 2013-11-21.txt」) を使用して、FASTA ファイルから提供される情報のそれらを置き換えました。 タンパク質の記号については、すべての場合において斜体ではなく、すべて大文字の遺伝子名を使用します。 あいまいなエントリは、Ensembl のオルソログ検索機能と GeneCards (http://www.genecards.org) を使用して解決されました。

(2) 反転されたエントリおよび汚染されたエントリを削除します。 MaxQuant によって「潜在的な汚染物質」または「リバース」としてマークされたすべてのエントリは削除されました。 「部位によってのみ識別される」とラベル付けされたタンパク質は保持されました。

(3) ペプチドの 20% 以上を共有するタンパク質をグループ化します。 あるタンパク質のペプチド セットが別のタンパク質のペプチド セットと同一であるか、その中に完全に含まれている場合、MaxQuant はそれらのタンパク質をグループ化します (「冗長グループ」)。 最大数のペプチドを含むエントリを使用して、冗長グループを特定しました。 同定されたペプチドの 20% 以上を共有する重複グループは、分析でさらにグループ化されました (「共有ペプチド グループ」)。 それに関連する最大の強度を持つエントリを使用して、共有ペプチド グループを特定しました。 これらのグループは、「_ 5_GROUPS _LIST.txt」というラベルの付いたファイルにリストされています。

(4) 出力を準備します。 より限定された情報セットを含む新しいファイル (「proteinGroups 2013-12-18c_4_FINAL.txt」) が生成されました。

Mathematica ファイルからの出力は Excel にインポートされました。 ProteomeXchange にデポジットされたファイルには、処理に使用されたすべての式がそのまま残っています。 次の手順が実行されました。

(5) riBAQ を計算します。 サンプル中の各タンパク質の相対存在量を生成するために、タンパク質の iBAQ 値をそのサンプルのすべての非汚染物質 iBAQ 値の合計で割って、相対 iBAQ (riBAQ) を算出しました。 私たちは、平均して、riBAQ がタンパク質存在量の正確な尺度であることを示しました9。

(6) 生物学的複製の平均と標準偏差を計算します。 対数変換ではなく、riBAQ 値の平均偏差と標準偏差を計算しました。

(7) 各発達年齢における BUN/UTR 濃縮度を計算します。 これらの濃縮値により、真のバンドル成分である可能性が高いタンパク質を夾雑物から分類することができます。

(8) P5/P23 濃縮度を計算します。 これらの比率により、発生調節されたタンパク質の同定が可能になります。

この記事を引用する方法: Krey、JF et al. マウスの前庭毛束のプロテオームは発生過程で束になります。 科学。 データ 2:150047 doi: 10.1038/sdata.2015.47 (2015)。

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この研究は、PGB-G への NIH 助成金 R01 DC002368、R01 DC011034、および P30 DC005983、および JFK への F32 DC012455 によって支援されました。OCTRI パイロット助成金 (CTSA 賞 UL1 TR000128 より) も支援に使用されました。

オレゴン聴覚研究センターおよびボルラム研究所、オレゴン健康科学大学、ポートランド、97239、オレゴン州、米国

ジョセリン・F・クレイ & ピーター・G・バー・ガレスピー

WM Keck Biomedical Mass Spectrometry Lab、バージニア大学、シャーロッツビル、22908、バージニア州、米国

ニコラス・E・シャーマン & エリン・D・ジェフリー

オレゴン健康科学大学公衆衛生および予防医学学部、ポートランド、97239、OR、米国

チェ・ドンソク

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JFK はすべての実験を実施し、原稿を編集しました。 NES と EDJ は質量分析を実施しました。 DC は統計分析を実行しました。 PGB-G。 データを分析して原稿を書きました。 著者全員が原稿を確認し、承認しました。

ピーター・G・バー・ガレスピーへの通信。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Krey, J.、Sherman, N.、Jeffery, E. 他マウスの前庭毛束のプロテオームは発生過程で束になります。 Sci Data 2、150047 (2015)。 https://doi.org/10.1038/sdata.2015.47

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受信日: 2015 年 5 月 27 日

受理日: 2015 年 8 月 13 日

公開日: 2015 年 9 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/sdata.2015.47

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