ROR2は自己調整します

Oct 31, 2023

Nature Communications volume 13、記事番号: 4449 (2022) この記事を引用

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4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

毛包は、毛包幹細胞 (HFSC) によって促進される再生サイクルを経ます。 β-カテニン依存性の標準的なWntシグナル伝達は広く研究されており、HFSCの活性化と運命決定に関与していると考えられているが、HFSCにおけるβ-カテニン非依存性のWntシグナル伝達の機能についてはほとんど知られていない。 この研究では、HFSC における Wnt 受容体である ROR2 の機能的役割を調査します。 Ror2枯渇したHFSCを分析することにより、ROR2はHFSCの活性化と自己複製を担うWnt活性化シグナル伝達の調節に必須であるだけでなく、適切なATM/ATR依存性のDNA損傷応答を維持するためにも必要であることが判明した。 HFSCの長期維持には不可欠です。 β-カテニンを欠くHFSCの分析において、我々は、β-カテニン欠損HFSCを幹細胞プールの損失から保護する際のROR2-PKCシグナル伝達の代償的役割を特定した。 まとめると、我々の研究は、幹細胞の自己複製と維持の調節におけるこれまで認識されていなかったROR2の役割を明らかにした。

哺乳動物では、Wnt シグナル伝達は組織の形態形成、幹細胞の活性化、および腫瘍の発生に機能します 1,2。 分泌された Wnt リガンドが受容体および/または共受容体に結合すると、β-カテニン依存性の標準的 Wnt シグナル伝達経路とβ-カテニン非依存性の非標準的 Wnt シグナル伝達経路に分類できる多様なシグナル伝達カスケードが開始されます 1。 これらの経路は、さまざまな細胞機能を調整するために独立してまたは協力して作用する可能性があります。

正規の Wnt シグナル伝達 (Wnt/β-カテニンシグナル伝達と呼ばれる) は、Wnt リガンドが Frizzled (Fzd) および LRP-5/6 に結合すると活性化され、これが Disheveled (Dvl) タンパク質の活性化を引き起こし、破壊複合体の阻害につながります。 、Axin、カゼインキナーゼ 1α (CK1α)、腺腫性ポリポーシス コリ (APC)、およびグリコーゲン シンターゼ キナーゼ 3β (GSK3β) によって構成され、それによって β-カテニンを安定化します 3,4。 安定化された β-カテニン タンパク質は核に移行し、そこでリンパ球増強因子/T 細胞因子 (LEF/TCF) タンパク質に結合して、標的遺伝子の発現を活性化します5。 Wnt/β-カテニンシグナル伝達とは異なり、β-カテニン非依存性のWnt経路には、交差接続されている可能性のある複数の細胞内シグナル伝達カスケードが関与しています。 非標準的な Wnt シグナル伝達の誘導は細胞内カルシウムの放出を引き起こす可能性があり、これによりカルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ II (CaMKII) やプロテインキナーゼ C (PKC) などの下流プロテインキナーゼが活性化されます 6,7,8。 非標準的な Wnt シグナル伝達は、c-Jun N 末端キナーゼ (JNK) および転写調節のために下流の活性化プロテイン 1 (AP-1) 複合体を活性化する、または細胞骨格を直接調節する低分子 GTPase の Rho ファミリーを介して伝達されることもあります。平面細胞極性 (PCP) と細胞移動を調整する組織 9、10、11、12、13。

受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体 2 (ROR2) は、当初、ROR1 とともに Trk ファミリーのチロシンキナーゼとして同定され 14、その後、非標準 Wnt と相互作用する能力により Wnt (共) 受容体の 1 つとして認識されました。 Wnt4、Wnt5a、および Wnt1115,16 を含みます。 遺伝子研究では、Ror2-/- マウスが Wnt5a-/- マウスと顕著な類似性を示したことが示されており、これらが同じシグナル伝達経路で機能する可能性があることが示唆されています 10,17。 脊椎動物では、ROR2 は Wnt5a 誘導性の細胞遊走、つまり JNK、PKC、アクチン結合タンパク質フィラミン A、および GTPase の Rho ファミリーの活性化に関与する機能に必要です 17、18、19、20、21。 Wnt-ROR2 の相互作用は、AP-1 と Rac122,23 の活性化を誘導する Dvl のリン酸化を引き起こします。 さらに、ROR2 は、Wnt/β-カテニンシグナル伝達において重要な役割を果たすキナーゼである CK1 および GSK3 と相互作用し、リン酸化されることが示されました 20、24、25、26。 複数の系において、Wnt5a はβ-カテニンを介した標準的な Wnt シグナル伝達を阻害することが示されました 27、28、29。 ROR2がWnt/β-カテニンシグナル伝達のWnt5a依存性拮抗作用を媒介する性質については、依然として議論の余地がある。 特定の状況下では、Wnt5a は、ROR222、30、31、32、33 を介した Wnt3a 誘導性 β-カテニン シグナル伝達を阻害します。 他の例では、ROR2 はこの阻害に必要ありません 10、26、34。 対照的に、ROR2 は Wnt/β-カテニンシグナル伝達を増強することも報告されています。 骨肉腫細胞では、ROR2 は Wnt135 に対する転写応答を増強します。 肺癌細胞では、ROR2 は Fzd231 との共受容体として Wnt3a 誘導性の標準 Wnt シグナル伝達を活性化します。 ROR2 を過剰発現すると、β-カテニン媒介転写が増強されます。 逆に、ROR2 をノックダウンすると、腎がん細胞では ROR2 が減少します 36。 Wnt/β-カテニンシグナル伝達におけるROR2の効果を分析した研究は、主にタンパク質の過剰発現とWnt/β-カテニンシグナル伝達活性のレポーターアッセイに依存していることは注目に値します。 Wnt シグナル伝達活性における ROR2 の生理学的効果については、さらなる研究が必要です。

体内のすべての細胞は、突然変異原などの外因性要因、または酸化ストレスなどの内因性プロセスによって引き起こされる DNA 損傷にさらされています。 したがって、組織の恒常性を確保し、がんなどの有害な疾患の発症を防ぐゲノムの完全性を維持するには、DNA損傷応答（DDR）を介したDNA修復が、特に成体幹細胞（SC）にとって非常に重要です。成人組織における長期間の使用 37,38。 変異型毛細血管拡張性運動失調症 (ATM) および ATM および Rad3 関連 (ATR) は、主にゲノム損傷によって活性化される DDR キナーゼです。 ただし、DNA 損傷特異性における ATM と ATR の機能は異なります 39,40。 DNA 損傷に応答して、ATM と ATR は活性化され、ATM の場合はチェックポイント キナーゼ 2 (CHK2)、ATR の場合はチェックポイント キナーゼ 1 (CHK1) などの下流シグナル伝達タンパク質をリン酸化し、それによって細胞周期チェックポイント、DNA 修復、またはアポトーシスを制御します 39,40 、41。 DDRとは独立して、ATMとATRの両方が、不均衡な酸化代謝および/または未修復のDNA損傷の蓄積によって引き起こされる可能性のある活性酸素種（ROS）の過剰産生によっても活性化される可能性があります42、43、44、45。 ROS に応答して、ATM は 5' AMP 活性化プロテインキナーゼ (AMPK)43,46 と核因子赤血球 2 関連因子 2 (NRF2)47,48 の活性化を誘導して、それぞれ酸化代謝を調節し、ROS と戦う抗酸化反応を誘導します。 。 SC における ATM 依存性 DDR の欠損は、自己再生障害またはアポトーシスの障害を引き起こす可能性があり、幹細胞の数とその機能に影響を与える可能性があります 49,50,51。

毛包（HF）は、幹細胞の活性化と維持を調節する根本的なメカニズムを研究するための優れたモデルシステムです52。 成熟した HF は、成長期 (成長期)、変性期 (退行期)、そして休止期 (休止期) のサイクルを経て進行します 53,54。 毛包幹細胞（HFSC）は、休止期のHFの膨らみに位置し、毛周期の休止期の間は静止したままです。 成長期の開始時に、HFSC の一部が増殖し、下方に移動して下部 HF55 を補充します。 HFSC の活性化は、そのニッチ細胞から来る微小環境シグナルによって厳密に制御されています 56、57、58、59、60、61。 成長期の開始時には、上方制御された Wnt/β-カテニン シグナル伝達が、HFSC 活性化を支配する転写制御を指示します 62,63,64。 β-カテニンを欠く HFSC は毛髪の再生を受けることができません 62,63,65 が、HFSC のアイデンティティを失うことなく本来のニッチを維持することができます 63。 しかし、隣接する細胞が毛周期に沿ってさまざまなシグナル分子を分泌する豊かな環境において、β-カテニンヌルHFSCプールを維持するメカニズムが何であるかは依然として不明である。

この研究では、幹細胞の自己再生と維持の調節におけるROR2の驚くべき役割を特定しました。 遺伝的マウスモデルを使用して、HFSCにおけるRor2の枯渇がHFSC活性化の遅延、HFSCステムネス遺伝子の下方制御を引き起こし、最終的にはHFSC集団の喪失につながることを示した。 初代培養HFSCのRor2を枯渇させることにより、ROR2がWnt誘導性シグナル伝達およびATM/ATR依存性DDRの活性化に必須であり、それによってHFSCの遊走、増殖、維持を調節していることが判明した。 最後に、β-カテニンを欠くHFSCの分析において、β-カテニン欠損HFSCを幹細胞プールの損失や誤った運命分化から保護する上でROR2と下流のPKCが必要であることを確認した。 我々の結果を総合すると、ROR2がHFSCの活性化と遊走を制御するWntシグナル伝達を調節するだけでなく、HFSCの長期維持を確実にするための保護機構としても機能することが明らかになった。

HFSC は毛周期を通じて Wnt リガンドを発現するニッチに存在しますが 66、β-カテニン依存性の制御を除けば、HFSC における Wnt シグナル伝達の機能についてはほとんど知られていません。 この未解決の疑問に取り組むために、我々は、β-カテニン依存性および非依存性の Wnt シグナルを伝達できる Wnt 受容体 ROR2 に焦点を当てました 17,18,19,20,21,31,35。 まず、皮膚全体の免疫染色を使用して、HF における ROR2 の発現を調べました。 示されているように、ROR2はHFSCおよびバルジ（Bu）の隣接細胞ではかなりよく発現されていますが、二次毛胚（HG）では比較的発現率が低いです（図1aおよび補足図1a）。 注目すべきことに、バルジにおけるROR2発現は、休止期よりも成長期開始時のHFの方が高い（補足図1b）。 蛍光活性化セルソーティング（FACS）を使用して、休止期（静止期 HFSC; qHFSC と呼ばれる）および成長期開始期（活性化 HFSC; aHFSC と呼ばれる）のマウス HF からインテグリン α6high/CD34+ HFSC を精製することにより、ROR2 タンパク質レベルが上昇していることを確認しました。 qHFSCと比較したaHFSC（図1bおよび補足図1c）。 上方制御されたROR2がHFSC活性化にとって機能的に重要であるかどうかを判断するために、K15プロモーター（K15CrePGR）によって駆動される誘導性Creリコンビナーゼを保有するマウス系統を条件的Ror2対立遺伝子（Ror2fl/fl）を保有するマウスと交配することにより、K15CrePGR;Ror2fl/fl;ROSA26LSL-YFPマウスを作製した。 fl）およびCre活性化YFPレポーター（ROSA26LSL-YFP）、および生後（P）18〜25日目のHFSCおよびその子孫のRor2遺伝子を枯渇させました（図1c）。 FACSで精製したRor2コンディショナルノックアウト（Ror2 cKO）HFSCではROR2発現が損なわれており（図1dおよび補足図1d）、ROR1はかなり発現したままである一方、Ror2 cKO HFのバルジでも減少していることが観察されました（補足図1d）。 1e)。 毛周期の進行を分析することにより、Ror2 cKO HFは、対照（Ror2 Ctrl）HFと比較して、成長期移行の遅延を示すことがわかりました（図1e）。 Ror2 cKO HFの成長期侵入の遅れとRor2 cKO動物の毛皮の回復によって証明されるように、成長期開始時の次の毛周期で成長期侵入の遅延が継続的に検出されました（補足図1f）。 Ror2 cKO HFにおける成長期移行の遅延がHFSC活性化の欠陥によって引き起こされたかどうかを検討するために、我々は成長期開始時のマウスにEdUを24時間投与した。 CD34およびEdUのRor2 CtrlおよびcKO皮膚の免疫染色は、Ror2 cKO HFのYFP +バルジにおけるEdU +増殖性HFSCの有意な減少を示し（図1f）、Ror2 cKO HFSCが細胞増殖の低下を示したことを示唆しています。

a ROR2 (赤) および CD34 (緑) の成長期開始時および休止期におけるマウス HF のホールマウント免疫蛍光染色。 ぶ、膨らみ。 HG、毛胚。 b ROR2 発現は活性化された HFSC で上方制御されます。 P55 (静止 HFSC; qHFSC) および P22-23 (活性化 HFSC; aHFSC) マウス背部皮膚からの FACS 精製 HFSC の、ROR2 および β-アクチンに関するイムノブロット分析。 独立した実験による ROR2 タンパク質レベルの定量化を以下のグラフに示します。 データはβ-アクチンに対して正規化されました。 値はqHFSCと比較することによって計算され、平均±sdとして報告されました。 n = 独立した FACS で分類された HFSC からの 4 つのブロット。 *p = 0.0117。 c Ctrl同腹子と比較した、Ror2 cKOマウスの毛周期開始の遅れを示す概略図。 マウスをRU486で処理して、P18〜25にHFSC内のCreリコンビナーゼを活性化した。 M形態形成、Tel休止期、Ana成長期、Cat退行期、M男性、F女性。 d FACSで精製したRor2 CtrlおよびcKO HFSCを使用した、成長期開始期（Ana）および後期休止期（後期Tel）からのリアルタイムPCR分析。 値は、Ror2 Ctrl HFSC mRNA に対して正規化されました。 データは平均±標準偏差として報告されます。 n = 5 (Ana) または 4 (Late Tel) 生物学的に独立した動物。 **p < 0.005。 e 示された生後 (P) 日目の Ror2 Ctrl および cKO マウスの背中の皮膚の H&E 染色 (上)。 Ror2 cKO HF の成長期移行の遅延を示す、指定された毛周期段階における HF の割合の定量化 (下)。 f Ror2 cKO HFSC は、成長期の開始時に活性化の遅延を示します。 24 時間の EdU 標識後、P32 メスの皮膚を免疫染色し (左)、定量化しました (右)。 Mx、行列。 データは中央値 (ボックス内の線)、25 ～ 75 パーセンタイル (ボックスの下および上の線)、および 10 ～ 90 パーセンタイル (下および上のひげ) として報告されます。 n = 7 (Ctrl) または 4 (cKO) の HF を 1 対の動物で検査。 **p = 0.0031。 すべての p 値は、対応のない両側 t 検定を使用して計算されました。 a、e、fのスケールバーは50μmを表します。 すべての結果は、少なくとも 2 つの独立した実験の代表です。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

HFSC活性化におけるROR2の役割をさらに検証するために、第2休止期の脱毛によって同期して活性化されたHFSCにおけるRor2枯渇の影響も分析しました（補足図2a）。 脱毛された Ror2 Ctrl および cKO 皮膚を用いた組織学分析および EdU 標識実験では、Ror2 cKO 皮膚における脱毛誘発性 HFSC 活性化と成長期進入の遅延が示されました (図 2a および補足図 2b)。これは毛髪で見つかったことと一致しています。ホメオスタシス中のサイクリング（図1e、f）。 HFSC 増殖欠陥は、成長期開始時の Ror2 Ctrl および cKO HF からの FACS 精製 HFSC で再現される可能性があります。 具体的には、初代HFSCをHFSCの増殖を促進する培地中で線維芽細胞フィーダー細胞とともに培養した場合、Ror2 cKO HFSCはCtrl HFSCよりも少ないコロニー数を示し（図2b）、これはRor2 cKO HFSCの増殖能力が損なわれていることを示しています。 Wnt/β-カテニンシグナル伝達がHFSCの活性化に必須であり、過剰発現したROR2が培養細胞において標準的なWntシグナル伝達を伝達できることを考えると 31,35、Ror2 cKO HFSCの活性化の遅れは、部分的にはβ-カテニンの障害によって引き起こされている可能性がある。 Wnt シグナル伝達活性に依存します。 この可能性に対処するために、定量的逆転写 PCR (RT-qPCR) 分析を実行することにより、脱毛後 3 日 (3dpd) の皮膚から採取した FACS 精製 Ror2 Ctrl および cKO HFSC における Wnt/β-カテニン標的遺伝子 63 の発現を調べました。 図2cに示すように、β-カテニン依存性Wntシグナル伝達に応答する遺伝子の発現は、脱毛活性化されたRor2 cKO HFSCにおいて有意に下方制御された。 このダウンレギュレーションは、毛周期中の成長期開始時にRor2 cKO HFSCでも検出されました（図2d）。 これらの結果は、HFSCの増殖と成長期の進行を促進するWnt/β-カテニンシグナル伝達の活性化がROR2に依存しており、Ror2枯渇による標準的なWntシグナル伝達活性の低下がHFSC活性化の遅延につながることを示唆している。

a 脱毛活性化された Ror2 cKO HFSC は活性化に遅延を示します。 脱毛から 2 日後、EdU 標識から 24 時間後に、脱毛した皮膚を免疫染色し (左)、定量化しました (右)。 データは中央値 (ボックス内の線)、25 ～ 75 パーセンタイル (ボックスの下および上の線)、および 10 ～ 90 パーセンタイル (下および上のひげ) として報告されます。 n = 8 (Ctrl) または 10 (cKO) の HF を 1 対の動物について調べた。 ***p < 0.0001。 スケールバーは 50 μm を表します。 b 成長期開始背中皮膚からのRor2 CtrlおよびcKO HFSCのコロニー形成効率（CFE）。 FACS 精製 HFSC からのコロニーをローダミン B で染色します (左)。 CFE の定量化 (右)。 サイズが 3 mm2 以上のコロニーの数を数えました。 データは平均±標準偏差として報告されます。 n = 3 つの独立したウェル; *p = 0.0269。 結果は少なくとも 2 つの独立した実験の代表です。 c、d FACS精製Ror2 CtrlおよびcKO HFSCを使用した、脱毛3日後（c）または成長期開始時（d）のWnt / β-カテニン標的遺伝子のリアルタイムPCR分析。 値は、Ror2 Ctrl HFSC mRNA に対して正規化されました。 e、f 脱毛後3日（e）または休止期後期（f）のFACS精製Ror2 CtrlおよびcKO HFSCを使用したHFSCステムネス遺伝子のリアルタイムPCR分析。 c〜fのデータは平均±sdとして報告されます。 n = 4 生物学的に独立した動物。 *p < 0.05、**p < 0.005、***p < 0.0005。 g 脱毛前（左）および脱毛後3週間（中央）のRor2 CtrlおよびcKO HFからのインテグリンα6high/CD34+ HFSC集団におけるYFP+細胞のFACS分析。 ドットプロット (右) は、脱毛後 3 週間で回復した YFP+ HFSC の割合を示します。 データは平均値±SEMとして報告されます。 n = 4 生物学的に独立した動物。 *p = 0.0365。 h 第2休止期のRor2 CtrlおよびcKO HFからのインテグリンα6high/CD34+ HFSC集団におけるYFP+細胞のFACS分析。 ペアのドット プロットは、Ror2 Ctrl HF と比較して Ror2 cKO HF における YFP+ HFSC のパーセンテージの減少を示しています。 n = 同腹子の独立したペア 10 組。 ***p = 0.0003。 すべての p 値は、対応のない両側 t 検定を使用して計算されました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

Wnt / β-カテニン標的遺伝子に加えて、脱毛活性化されたRor2 cKO HFSCは、Ctrl HFSCと比較して、広範囲のHFSCステムネス遺伝子の有意な下方制御を示すこともわかりました（図2e）。 これらの遺伝子の下方制御は、HFSCが活性化のために準備されたとき、第2休止期後期のRor2 cKO HFSCでも見られました（図2f）。 これらの結果から、我々は、HF 再生中の HFSC プールの維持にも ROR2 が必要である可能性があると仮定しました。 この仮説を検証するために、マウスの毛皮を脱毛し、FACS を使用して、脱毛前と、新たに形成された HF が休止期に戻った脱毛 3 週間後のインテグリン α6high/CD34+ HFSC 集団における YFP+ 細胞の割合を測定しました。 図2gに示すように、YFP + Ror2 Ctrl HFSCは、HF再生が完了した後も幹細胞ニッチに完全に維持されましたが、YFP + HFSCの約82％のみが以前のRor2 cKO HFSCプールから回収され、一部のRor2 cKO HFSCがHF 再生中に失われます。 同様の現象が、毛周期中に Ror2 cKO HFSC で検出されました。 第2休止期におけるRor2 CtrlおよびcKO HFのα6high/CD34+ HFSC集団におけるYFP+細胞の割合を調べることにより、Ror2 cKO HFは、ペアのRor2 Ctrl HFよりもHFSCプール中のYFP+細胞の割合が低いことを発見しました（図1）。 2h)、一部の Ror2 cKO HFSC がヘアサイクル後に回復しなかったことを示しています。 ただし、Ror2 cKO HFSCが最初の脱毛を通じて生き残ることができた場合、それらは繰り返しの脱毛時にその後のHF再生を維持できることに気づきました（補足図3a）。 これは、YFP + Ror2 cKO HFSCが一部の古いHFでかなり維持できる理由を説明する可能性があります（補足図3b）。 この結果は、回収された Ror2 cKO HFSC では、ROR2 の損失が他の要因によって補われる可能性があることを示唆しています。

まとめると、我々の結果は、ROR2 が Wnt/β-カテニンシグナル伝達活性の調節を介した HFSC 活性化に必要であること、また in vivo での HFSC 集団の維持にも必要であることを示唆しています。

HF再生中にRor2 cKO HFでHFSCプールが減少することが判明したため、コロニー形成アッセイを実行し、続いて休止期のRor2 CtrlおよびcKO HFからFACS精製したHFSCで長期培養することにより、HFSC維持能力を評価しました。 我々は、テロゲンRor2 cKO HFSCも、増殖を促進する培地中でコロニー数の減少を示し（図3a）、自己複製能力の欠陥を示していることを発見した。 フィーダー層上で増殖した単一の HFSC コロニーを選択し、培養で連続継代した場合、Ror2 cKO HFSC は長期間維持できませんでした (図 3b)。 さらに、フィーダー細胞から除去すると、Ror2 cKO HFSCは増殖能力を失い、分化した形態を示しました（図3c）。 これらの分化様のRor2 cKO HFSCは、増殖の低下に対応してサイクリンD1（Ccnd1によってコードされる）の発現が低下しただけでなく、HFSCマーカーであるCd34およびKrt15の発現も失い（図3d）、ROR2が維持するために不可欠であることを示唆しているHFSCのアイデンティティ。 総合すると、培養中の精製 HFSC からの結果は、ROR2 が HFSC の自己再生と維持において重要な役割を果たすことを実証する我々の in vivo 研究を裏付けています。

休止期の背中の皮膚からのRor2 CtrlおよびcKO HFSCのCFE。 FACS 精製 HFSC からのコロニーをローダミン B で染色します (左)。 CFE の定量化 (右)。 サイズが 3 mm2 以上のコロニーの数を数えました。 データは平均±標準偏差として報告されます。 n = 3 つの独立したウェル。 **p = 0.0007。 結果は少なくとも 2 つの独立した実験の代表です。 b Ror2 cKO HFSC は継代して長期間維持することができませんでした。 個々の Ror2 Ctrl または cKO HFSC コロニーを単離、培養、継代しました。 Ror2 の枯渇が個々のコロニーについて確認されました。 (左) Ror2 Ctrl HFSC は、YFP 発現によって証明されるようにフィーダーで継代および維持できましたが、YFP+ Ror2 cKO HFSC は継代中に失われました。 白い破線は、HFSC コロニーの輪郭を示します。 スケールバーは 200 μm を表します。 (右) Ror2 cKO HFSC を培養下で長期間維持できないことを示すプロットグラフ。 データは平均±標準偏差として報告されます。 n = 3 グループ、グループあたり 6 つのコロニーを調べました。 c 培養された Ror2 cKO HFSC は、分化様の形態と増殖能力の低下を示します。 (左) 長期培養した Ror2 Ctrl および cKO HFSC の微分干渉コントラスト (DIC) 画像。 (右) Ror2 Ctrl および cKO HFSC の増殖能力を、毎日の細胞数のカウントに基づいて測定しました。 データは平均±標準偏差として報告されます。 個々のサンプルの n = 3 ウェル。 スケールバーは 50 μm を表します。 d 培養された Ror2 cKO HFSC は、HFSC マーカー、Cd34 および Krt15 の発現の低下を示します。 より高度に継代されたRor2 CtrlおよびcKO HFSCからのmRNAのqPCR（左）および免疫ブロッティング（右）。 データは平均±標準偏差として報告されます。 n = 3 個の独立した HFSC コロニー。 Ror2、**p < 0.0001; Ccnd1、**p = 0.0001; Cd34、**p = 0.0075; Krt15、**p = 0.0028。 すべての p 値は、対応のない両側 t 検定を使用して計算されました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

精製された Ror2 cKO HFSC は培養液中で維持できないため、条件付き Ror2 対立遺伝子 (Ror2fl/fl) および YFP レポーター (ROSA26LSL-YFP) を保有する HFSC を培養し、培養液中でレンチウイルス Cre リコンビナーゼを形質導入することにより、Ror2-/- HFSC を生成しました (補足図4a)。 このようにして、Ror2の喪失によるHFSCにおけるシグナル伝達と遺伝子発現の変化を調べることができました。 我々はまず、HFSCにおけるRor2枯渇の効率を確認した。 示されているように、ROR2タンパク質の発現はCre発現（Ror2-/-）HFSCでは完全に廃止されましたが、ROR1の発現は継代中にRor2-/- HFSCで上昇しました（左パネル、図4a）。 次に、Wnt 刺激に対する Ror2-/- HFSC の応答を調べることにより、Ror2-/- HFSC の特徴を調べました。 以前の研究では、ROR2 が JNK、PKC、および低分子 GTPase の活性化を介して Wnt5a 誘導性の細胞遊走を媒介することが示されています 17、18、19、20、21。 ここで、我々は、Wnt5aによって誘導されるJNKおよびPKCの活性化、ならびにRac1およびCdc42の活性について、対照(Ror2+/+)およびRor2-/- HFSCを調べた。 Wnt刺激したHFSCを用いてウエスタンブロッティング分析を行うことにより、Dvl2がリン酸化され（図4aの左パネルの上部のバンド、矢印）、古典的および新規サブファミリーの下流エフェクターJNKタンパク質およびPKCタンパク質（本明細書ではPKCと呼ばれる）がリン酸化されていることを示した。研究）は、Ror2+/+ HFSCではWnt5a刺激により活性化されましたが、これらの活性はRor2-/- HFSCでは減弱されました（+Wnt5a、左パネル、図4a）。 Rac1 および Cdc42 の活性型 (GTP 結合型) を認識するグルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST) 融合タンパク質を使用する確立された Small GTPase 活性化アッセイを使用したところ、Wnt5a 刺激に関係なく、Rac1 および Cdc42 の活性が Ror2 で顕著に低下することがわかりました。 −/− HFSC（図4b）。 注目すべきことに、ROR1は培養Ror2-/- HFSCにおいて上方制御されていたが、この上方制御はWnt5a-ROR2媒介シグナル伝達制御を補うには不十分であると思われる。 これらのデータを総合すると、HFSC における Wnt5a 依存性シグナル伝達の伝達における ROR2 の重要な役割が実証されています。

a Ror2+/+ および Ror2-/- HFSC を Wnt5a または Wnt3a で 30 分間および 60 分間処理した後、イムノブロッティングのために収集しました。 矢印は、Dvl2 タンパク質のリン酸化型を示します。 タンパク質レベルの変化倍数の値は、示されたバンドの下に示されています。 データはβ-アクチンまたはα-チューブリンに対して正規化し、0'でRor2+/+ HFSCと比較することによって計算しました。 リン酸化された総タンパク質の経時的定量を以下に示します。 b Ror2+/+ および Ror2-/- HFSC を Wnt5a で 2 時間処理し、GTP 結合 Rac1 または Cdc42 をプルダウンし、小規模 GTPase 活性化アッセイを使用して同定しました。 タンパク質レベルの定量化が表示されます。 総タンパク質のデータは、β-アクチンに対して正規化されました。 c ROR2は、標準的なWntシグナル伝達の転写活性化に必要です。 HFSCを一晩飢餓状態にしてから、Wnt3aで6時間処理しました。 Wnt3a 誘導の倍率は、Wnt3a 処理 HFSC をビヒクル処理対応物と比較することによって計算されました。 縮小のひだはバーの上に示されています。 データは平均±標準偏差として報告されている。GSK3β活性の阻害により、Ror2-/- HFSCにおける標準的なWnt標的遺伝子の発現が回復する。 DMSO (媒体) または CHIR-99021 (GSK3i) で 24 時間処理した Ror2+/+ および Ror2-/- HFSC のリアルタイム PCR 分析。 e Ror2-/- HFSCは、Wnt5a誘導性の細胞遊走に応答しません。 Ror2+/+ および Ror2-/- HFSC の遊走能力を、化学誘引物質として Wnt5a または血清を用いたトランスウェル細胞遊走アッセイによって調べました。 f Ror2、Ror1、HFSCステムネス、およびHF運命関連遺伝子に関するRor2+/+およびRor2-/- HFSCのリアルタイムPCR分析。 HFSCの静止状態に関連するNfatc1を除いて、Ror2-/- HFSCは、より低いレベルのHFSCステムネスおよびHF運命関連遺伝子を発現することに留意されたい。 d – f のデータは平均値 ± SD として報告されます。 n = 3 回の独立した実験。 *p < 0.05、**p < 0.005、***p < 0.0005。 すべての p 値は、対応のない両側 t 検定を使用して計算されました。 すべてのイムノブロッティングの結果は、少なくとも 2 つの独立した実験の代表です。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

Wnt5aだけでなく、標準的なWntリガンドであるWnt3aも、ROR2非依存的にHFSC内のJNKを活性化することができました（+Wnt3a、左パネル、図4a）。 興味深いことに、Ror2の枯渇は、Wnt3aによって誘導されるGSK3βの不活性化とAxin1の分解を著しく損なう可能性があります（+Wnt3a、右パネル、図4a）。 示されているように、Wnt3a と Wnt5a の両方の刺激は、Ser-9 リン酸化の増加によってモニターされる GSK3β 不活化を誘導する可能性があります。 しかし、この不活化はRor2-/- HFSCでは消失した(右パネル、図4a)。 驚くべきことに、GSK3βの全体的な不活性型は対照HFSCのものよりも低かったが（右パネル、図4a）、Tyr-216でのGSK3βのリン酸化は変化しなかった（補足図4b）。 GSK3β は構成的に活性なキナーゼであると考えられているため 67,68、その不活性型のレベルの低下は GSK3β キナーゼ活性の上昇を示唆しています。 実際、Ror2-/- HFSCにおけるGSK3βの活性上昇は、p-β-カテニンS33/37/T41の増加によって確認された（右パネル、図4a）。 p-LRP6S1490の増加は、Ror2-/- HFSCにおけるGSK3β活性の上昇の他の証拠である（右パネル、図4a）。 この観察と一致して、Ror2-/- HFSCは、Ror2+/+ HFSCと比較して、標準Wnt標的遺伝子のWnt3a誘導性発現の有意な減少を示すことも発見しました（図4c）。 CHIR-99021（GSK3阻害剤; GSK3i）の処理によるGSK3β活性の阻害により、β-カテニンの総プールが増加し（補足図4c）、Ror2-/- HFSCの標準Wnt標的遺伝子の発現が回復しました（図4d） ）、Ror2-/- HFSCにおけるWnt/β-カテニンシグナル伝達の下方制御が、β-カテニン分解を促進する解き放たれたGSK3β活性によって引き起こされたことをさらに強調している。 これらの結果は、Wnt / β-カテニン標的遺伝子が活性化されたRor2 cKO HFSCで下方制御されていることを示すin vivoの発見を裏付け（図2c、d）、Wnt / β-カテニンシグナル伝達の下方制御が唯一ではなく1つである可能性があることを示唆しています、HFSCの活性化が遅れる原因。

JNK、PKC、および低分子GTPase活性の低下は、Ror2-/- HFSCがWnt5a誘導性の細胞遊走に欠陥を持っている可能性を示唆しました。 この可能性を探るために、Wnt5aまたは血清のいずれかを化学誘引物質として使用し、Ror2+/+およびRor2-/- HFSCを用いてトランスウェル細胞遊走アッセイを実施した。 図4eに示すように、Wnt5aはRor2+/+ HFSCの細胞遊走を有意に促進しましたが、この遊走効果はRor2-/- HFSCでは完全に消失しました。 追加の遊走刺激を含む血清による刺激でも、Ror2-/- HFSCは依然として効率的に遊走できず（図4e）、これはRor2-/- HFSCが細胞運動に欠陥があることを示唆している。 実際、スクラッチ創傷遊走アッセイで検査した場合、Ror2-/- HFSCは集団細胞遊走における能力の低下を示し（補足図4d）、HFSCの運動性の調節におけるROR2のかけがえのない役割を示しました。

さらに、我々の in vivo での発見（図2e、f）と一致して、培養Ror2-/- HFSCがHFSCステムネス遺伝子の発現を維持できないことも発見した。 実際、HFSC静止に関連するNfatc1を除いて、Ror2-/- HFSCは、より低いレベルのHFSCステムネス遺伝子およびHF運命関連遺伝子を発現した（図4f）。 まとめると、Ror2を欠く培養HFSCを用いた我々の分析は、ROR2がJNK、PKC、および低分子GTPアーゼの活性化を介してWnt5依存性シグナル伝達および細胞遊走を媒介するというこれまでの発見を裏付けるだけでなく、標準的なWnt-5を維持するには内因性ROR2が必要であることも実証している。 GSK3βの安定性の調節を介してβ-カテニンの転写活性化を誘導しました。

細胞遊走欠陥に加えて、EdU標識実験を行うことにより、EdUの取り込みを示すRor2-/- HFSCの数の減少によって証明されるように、S期DNA合成を受けるRor2-/- HFSCの数が少ないことも観察されました（図5a）。 興味深いことに、フローサイトメトリーによる細胞周期分析では、G0/G1期のRor2-/- HFSCの部分の減少と、S期とG2/M期の両方でのRor2-/- HFSCの蓄積が示されました（図5b）。 EdU標識および細胞周期分析の結果は、Ror2-/- HFSCがより遅いS期進行およびG2/M細胞周期停止を示すことを指摘した。 DNA 複製の減速は S 期 DNA 損傷チェックポイントの特徴であり、G2/M 細胞周期停止も DNA 損傷の結果です 69,70。 したがって、我々の結果は、Ror2-/- HFSC が DNA 損傷応答を開始していることを示唆しました。 DNA 損傷は、外因性の要因または内因性の原因によって引き起こされる可能性があります。 Ror2+/+ および Ror2-/- HFSC の培養条件が等しいことを考えると、酸化ストレスなどの内因性プロセスが Ror2-/- HFSC の DNA 損傷を引き起こす原因である可能性があります。 これらの可能性に対処するために、DNA 二本鎖切断 (DSB) のバイオマーカーである γH2AX 71 と、酸化的 DNA 損傷の影響を測定するためのバイオマーカー 72 である 8-オキソグアニン (8-oxoG) の免疫染色を実行しました。 図5cおよび補足図5aに示すように、6個を超えるγH2AX病巣を示すRor2+/+ HFSCの3倍以上のRor2-/- HFSCは、Ror2-/- HFSCにおけるDNA DSBの蓄積を示した。 また、かなりの割合のRor2-/- HFSCが8-oxoGの核染色を示しており、Ror2+/+ HFSCの核では検出されないものも見つかりました（図5d）。 Ror2-/- HFSC における 8-oxoG の核染色は、細胞内 ROS の産生の増加を示唆しました。 CellROX色素による染色によって判断されるように、ROSレベルは確かにRor2-/- HFSCで有意に高かった(図5e)。 我々の結果を総合すると、Ror2 の枯渇により過剰な ROS 産生と DNA 損傷の蓄積が生じ、その結果、増殖の遅延と細胞周期の停止が引き起こされることが示唆されます。

a Ror2-/- HFSC は細胞増殖の低下を示します。 HFSC は検査前に 4 時間 EdU で標識されました。 データは平均値±SEMとして報告されます。 n = 5 回の独立した実験。 ***p = 0.00001。 b Ror2 の枯渇により、S 期の進行が遅くなり、G2/M 期で細胞周期が停止します。 (左) HFSC の DNA 含有量を DAPI で染色し、フローサイトメトリーで分析しました。 (右) 棒グラフは細胞周期の分布を示しています。 c Ror2-/- HFSC は二本鎖切断の大幅な増加を示します。 γH2AX に対する Ror2+/+ および Ror2-/- HFSC の免疫蛍光染色 (赤)。 矢印はγH2AX 病巣を示します。 6 個を超える病巣を示す細胞の定量化を右に示します。 d ケラチン5（Krt5;緑色）および8-オキソグアニン（8-oxoG;赤色）に対するRor2+/+およびRor2-/- HFSCの免疫蛍光染色。 核内 8-oxoG を示す細胞の定量を右に示します。 e CellROX Deep Red試薬を使用した、Ror2+/+およびRor2-/- HFSCのROSレベルのフローサイトメトリー分析。 ROS レベルの変化倍数の値を右に示します。 f – i ATMおよびATR（f）、AMPK（h）、NRF2（i）の活性化タンパク質および総タンパク質、ならびにリン酸化ATM / ATR基質およびROR2（ g)。 ビンキュリン、α-チューブリン、およびβ-アクチンを、示された実験の内部対照として使用しました。 タンパク質レベルの変化倍数の値は、示されたバンドの下に示されています。 j GSK3β活性を阻害すると、Ror2-/- HFSCにおけるNRF2の発現レベルと活性が回復しますが、AMPKは回復しません。 DMSO (媒体) または CHIR-99021 (GSK3i) で 24 時間処理した Ror2+/+ および Ror2-/- HFSC を用いた免疫ブロット分析。 c と d のスケール バーは、それぞれ 15 μm と 50 μm を表します。 b〜eのデータは平均±sdとして報告されています。 n = 3 回の独立した実験。 **p < 0.005、**p < 0.0005 (b)、**p = 0.0035 (c)、**p = 0.0024 (d)、*p = 0.02 (e)。 すべての p 値は、対応のない両側 t 検定を使用して計算されました。 すべてのイムノブロッティングの結果は、少なくとも 2 つの独立した実験の代表です。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

ATM と ATR は DDR の中心的な制御装置であり、ATM は ROS のレベルを制御する酸化還元センサーとしても機能します。 ATM 欠乏は ROS レベルを増加させ、NRF2 依存性の抗酸化反応を低下させます 37,42,43。 Ror2-/- HFSCにおける過剰なROS産生とDNA損傷の蓄積により、我々はRor2の枯渇がATMおよび/またはATR依存性のDDRを損なう可能性があると仮定した。 この可能性をテストするために、ATM の活性と、DDR73 で ATM の相補的な制御因子として機能する可能性がある ATR の活性を調べました。 イムノブロット分析により、Ror2-/- HFSCにおけるATMの活性および総タンパク質発現の劇的な減少が示され、ATRについては程度は低いことが示されました（図5f）。 Ror2-/- HFSCにおけるATM/ATR活性の低下は、細胞周期チェックポイントとDNA修復を調節するATM/ATR基質のリン酸化レベルの低下によってさらに確認されました73（図5g）。 より具体的には、ATMおよびATRの直接の下流標的であるCHK2およびCHK1は、それぞれRor2-/- HFSCで下方制御された（補足図5b）。

ROSレベルの上昇により、Ror2-/- HFSCにおけるATMの下方制御により、ROS活性化ATM下流エフェクターであるAMPKおよびNRF2も損なわれる可能性がある。 実際、AMPKおよびNRF2のリン酸化は両方とも、対照細胞と比較してRor2-/- HFSCで減少した(図5h、i)。 NRF2の下方制御は、Ror2-/- HFSCの核における活性化NRF2の顕著な減少によってさらに証明された（補足図5c）。 興味深いことに、NRF2 の阻害により ATM および ATR 遺伝子の転写抑制が引き起こされる可能性があることが実証されました。 したがって、NRF2活性の劇的な低下は、ATMおよびATRの総タンパク質レベルがRor2-/- HFSCで顕著に低下した理由を説明する可能性がある。

GSK3β は、AMPK74 の活性を阻害し、NRF275 の分解を調節することも示されています。 したがって、Ror2-/- HFSC で解き放たれた GSK3β 活性は、そのダウンレギュレーションを引き起こす原因の 1 つである可能性があります。 実際、GSK3阻害剤の処理によるGSK3β活性の阻害は、Ror2-/- HFSCにおけるNRF2の発現レベルと活性をRor2+/+ HFSCのものと同等のレベルに回復させることができましたが、AMPK活性には影響を与えませんでした（図5j）。 ）。 このデータは、ROR2 喪失に起因する過剰な GSK3β 活性が、Ror2-/- HFSC における不均衡な酸化応答に部分的に寄与していることを示唆しています。 要約すると、我々の結果は、HFSCにおけるATM/ATR依存性DDRの制御におけるこれまで認識されていなかったROR2の役割を明らかにした。 ROR2がないと、HFSCはATM、ATR、およびその下流シグナル伝達の活性化の欠損に起因してDNA損傷を適切に修復できず、ROSの産生と除去のバランスをとることができず、最終的には細胞増殖の遅延、未修復のDNA損傷の蓄積、およびDNA損傷の増加につながります。 ROS（補足図5d）。

Ror2 cKO HFSC とは異なり、β-カテニンヌル HFSC は、HF サイクリング中に活性化できないにもかかわらず、ニッチな領域に長期間維持されます 63。 しかし、幹細胞プールからのβ-カテニンヌルHFSCの枯渇を防ぐメカニズムは依然として不明である。 β-カテニンの誘導性条件付き変異マウス系統（K15CrePGR;Ctnnb1fl/fl;ROSA26LSL-YFP）を使用して、HFSCおよびその子孫のβ-カテニンをP18〜25で枯渇させたところ、β-カテニンcKO（β-cat KO）が見出されました。 ）HFは、毛皮の回復の遅れと不能によってそれぞれ証明されるように、最初の毛周期で成長期への移行の遅れを示し、その後、残りの生涯を通じて2番目の休止期に留まりました（図6a）。 注目すべきことに、停止したβ-cat cKO HFは無傷のバルジコンパートメントを維持しました（図6a、右下）。これは、2番目のテロゲンでHFSCでβ-カテニンが枯渇した以前の研究でも見られました63。 興味深いことに、第 2 休止期の β-cat Ctrl および cKO HFSC における HFSC ステムネス遺伝子の発現を分析したところ、HFSC ステムネス遺伝子の発現レベルの低下と Ror2 発現の上方制御との関連が見つかりました。 初期の休止期では、β-cat cKO HFSC は、HFSC 幹細胞性遺伝子のレベルが同等かわずかに上昇していました。 これらの HFSC では、Ror2 mRNA の発現レベルは、コントロール HFSC の発現レベルと同等でした (図 6b、上)。 しかし、HFSCステムネス遺伝子の発現が低下した後期テロゲンβ-cat cKO HFSCでは、Ror2 mRNAのレベルが上昇しました（図6b、中央）。 Ror2発現の上昇は、高齢動物のβ-cat cKO HFSCで保持されました（図6b、下）。 一致して、後期休止期および老化期の β-cat cKO HFSC における Ror2 発現の上昇がホールマウント免疫染色によって確認され、ROR2 発現が第 2 休止期後期の Ctrl HF よりも β-cat cKO HF のバルジで高かったことが示されました (補足図6a）および高齢動物（補足図6b）。

a β-cat cKO HF は、HFSC コンパートメントを失うことなく永久に休止期に留まります。 (上) β-cat Ctrl マウスおよび cKO マウスの毛周期の進行を示す概略図。 (左下) β-Cat cKO マウスは、第 1 成長期 (P31) で毛皮の回復に遅れを示し、その後、次の毛周期に入ることなく第 2 休止期に永久にとどまります。年上の動物（P198）。 (右下) β-cat Ctrl および cKO マウスのホールマウント皮膚上の皮脂腺細胞のオイルレッド O 染色。 高齢動物のβ-cat cKO HF のバルジ コンパートメントは無傷であり、HFSC は維持されます。 b 初期（P55〜60）、後期（P65〜90）、および高齢（>P250）テロゲンHFからのFACS精製β-cat CtrlおよびcKO HFSCのリアルタイムPCR分析。 β-cat cKO HFSCの値を、各セットのβ-cat Ctrl HFSC mRNAに対して正規化しました。 c β-cat cKO HFにおけるRor2枯渇は、HFSCの喪失と誤った運命分化を引き起こす。 (上) Ror2/β-cat Ctrl、Ror2 cKO、β-cat cKO、および Ror2/β-cat dKO マウスの毛周期の進行を示す概略図。 (左下) Ror2/β-cat Ctrl、Ror2 cKO、β-cat cKO、および Ror2/β-cat dKO マウスのホールマウント皮膚上の皮脂腺細胞のオイルレッド O 染色。 (右下) 正常な構造、肥大した皮脂腺 (SG)、または縮小した隆起を伴う HF の定量化を示します。 d YFPに対するRor2 / β-cat CtrlおよびdKOマウスのホールマウント皮膚の免疫蛍光画像。 結果は少なくとも 3 つの独立した実験の代表です。 e HFSCステムネス遺伝子に関するRor2 / β-cat CtrlおよびdKO HFSCのリアルタイムPCR分析。 値は、Ror2/β-cat Ctrl HFSC の mRNA に対して正規化されました。 a、c、dのスケールバーは50μmを表します。 b と e のデータは平均値 ± SD として報告されます。 n = 4 (初期 Tel の場合)、5 (後期 Tel の場合)、または 3 (高齢 Tel の場合) 生物学的に独立した動物 (b)、n = 4 の生物学的に独立した動物 (e)。 *p < 0.05、**p < 0.005、***p < 0.0005。 対応のない両側 t 検定。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

β-cat cKO HFSC で上方制御された ROR2 が HFSC の維持に役割を果たしているかどうかを調べるために、Ror2 と β-カテニンの誘導性条件付き二重変異マウス系統 (K15CrePGR;Ror2fl/fl;Ctnnb1fl/fl;ROSA26LSL-YFP) を生成しました。 Ror2/β-cat dKOとして。 Ror2 および/または β-カテニンの枯渇は、P18 ～ 25 でマウスに RU486 を投与することによって開始されました。 Ror2 cKO マウスおよび β-cat cKO マウスと同様に、Ror2/β-cat dKO マウスも、第 1 毛周期での成長期移行の遅延を示しました (図 6c、上)。 ただし、第2成長期の開始時に、Ror2 cKO HFは継続的に成長期突入の遅延を示し（図1e）、β-cat cKO HFは休止期で停止しました（図6aおよび補足図7a）、Ror2 / β-猫の dKO HF は毛周期の開始に失敗し、大規模な皮脂細胞分化の兆候を示しました（図 6c および補足図 7b）。 Ctrl、Ror2 cKO、β-cat cKO、および Ror2/β-cat dKO マウスからの HF の定量分析により、肥大した皮脂腺 (SG) を示す表現型が Ror2/β-cat dKO HF でのみ観察され、 Ror2/β-cat dKO HF の半数は、異常な HF 構造またはバルジコンパートメントの減少を伴う SG の拡大を示しました (図 6c、下)。 ホールマウントHFの免疫染色により、SGの拡大とともにCD34 + Ror2 / β-cat dKO HFSCが徐々に減少することが明らかになりました（補足図7c）。 YFPによる系統追跡により、拡大したSGに存在するこれらの分化した皮脂細胞がCre活性化YFP + Ror2 / β-cat dKO HFSCから生成されたことが確認されました（図6d）。 Ror2およびβ-カテニンの枯渇は、HFSCステムネス遺伝子の顕著な下方制御を示したFACS精製YFP+ Ror2 / β-cat dKO HFSCで確認されました（図6e）。 このダウンレギュレーションは、Ror2 cKO（図2e、f）または後期テロゲンβ-cat cKO HFSC（図6b）におけるダウンレギュレーションよりもさらに顕著でした。 要約すると、我々の結果は、HFSCの長期維持におけるこれまで認識されていなかったROR2の役割を解明するものであり、これは活性化時に誤った運命分化を受けるHFSCにとって特に重要である。

我々は、ROR2がWnt誘導性のJNKおよびPKCの活性化に必要であることを示しました（図4a）。 追加のWnt刺激がないと、JNKおよびPKCの全体的な活性はRor2-/- HFSCですでに低くなり、通常の増殖培地でp-GSK3βS9の大幅な減少が示されました（補足図8a）。 培養HFSC以外に、脱毛活性化Ror2 cKO HFSCでは、JNKおよびPKCタンパク質の総型と活性型の両方が大幅に減少していることもわかりました（図7a）。 成長期開始時のホールマウントRor2 CtrlおよびcKO皮膚の免疫染色により、脱毛活性化Ror2 cKO HFSCにおけるJNKおよびPKCタンパク質発現とそれらの活性の減少が確認されました（補足図8b）。 注目すべきことに、ROR2発現の減少を示したRor2 cKO HFSCにおけるPKC発現の減少は、休止期でも持続した(図7b)。 HFSCの増殖および維持におけるRor2枯渇の影響がRor2-/- HFSCにおけるJNKおよび/またはPKCの下方制御によって引き起こされたかどうかを検討するために、我々は小分子阻害剤であるSP600125（JNK阻害剤; JNKi）およびGF109203X（選択的PKC阻害剤）を使用した。培養 HFSC の JNK と PKC の活性をそれぞれ抑制するために、古典的および新規 PKC アイソフォーム;PKCi) を研究し、EdU 標識実験を行うことによって HFSC 増殖におけるそれらの効果を調べました。 示されているように、JNKではなくPKCの阻害により、Ror2+/+とRor2-/- HFSC間の細胞増殖の違いが消去され（補足図8c）、ROR2がPKC依存性シグナル伝達を介して少なくとも部分的にHFSC増殖を調節していることを示唆しています。

a 3dpd Ror2 Ctrl および cKO HF からの FACS 精製 HFSC のイムノブロッティング分析。 b ROR2（赤）およびPKCα（緑）の後期テロゲンRor2 CtrlおよびcKO HFのホールマウント免疫蛍光染色。 ROR2 および PKCα 染色の蛍光強度の定量分析を右に示します。 データは中央値 (ボックス内の線)、25 ～ 75 パーセンタイル (ボックスの下および上の線)、および 10 ～ 90 パーセンタイル (下および上のひげ) として報告されます。 n = 7 (Ctrl) または 8 (cKO) の独立した HF にわたる 18 (Ctrl) または 20 (cKO) の領域。 ***p < 0.0001。 対応のない両側 t 検定。 c DMSO (媒体) または GF109203X (PKCi) で 24 時間処理した Ror2+/+ および Ror2-/- HFSC を用いた、示されたタンパク質の免疫ブロット分析。 d β-cat cKO HFにおけるPKC阻害は、HFSCの喪失と誤った運命分化を引き起こす。 (上)第2休止期におけるPKC阻害剤で処置したRor2/β-cat Ctrl、dKOマウス、およびβ-cat cKOマウスの毛周期の進行を示す概略図。 (下) 1 週間後の処理後のホールマウントスキン上の皮脂細胞のオイルレッド O 染色 (左) と HF の定量 (右) を示します。 e 24時間アセトン（媒体）またはGF109203X（PKCi）で処理したβ-cat CtrlまたはcKOマウスからのFACS精製HFSCのリアルタイムPCR分析。 GF109203Xで処理したβ-cat CtrlおよびcKO HFSCの値を、それぞれビヒクルで処理したβ-cat CtrlおよびcKO HFSCのmRNAに対して正規化した。 データは平均±標準偏差として報告されます。 n = 3 匹の生物学的に独立した動物。 *p < 0.05、**p < 0.005。 対応のない両側 t 検定。 f この研究の結果を要約した図解モデル。 HFSCでは、ROR2は、PKC、JNK、および低分子GTPアーゼの活性化を介してWnt5a誘導性の非標準的Wntシグナル伝達を伝達するだけでなく、GSK3βの安定性を制御することによってWnt3a誘導性の標準的Wntシグナル伝達も調節する。 並行して、ROR2 は ATM/ATR に依存する DDR の制御にも役割を果たします。 これらの ROR2 依存性制御は、HFSC の長期維持に不可欠な細胞増殖、運動性、および DNA 修復を調節します。 すべてのイムノブロッティングの結果は、少なくとも 2 つの独立した実験の代表です。 b、dのスケールバーは50μmを表します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

PKC は GSK3β をリン酸化して不活化することが示されています 76,77 が、我々は、PKC 阻害が GSK3β 不活化を緩和することによって Ror2 喪失を部分的に再現できるかどうか疑問に思っています。 示されているように、PKC 阻害は、PKCi 処理時の PKC 活性および総タンパク質レベルの低下によって検証され、Ror2+/+ HFSC における GSK3β 不活化を Ror2-/- HFSC におけるものと同様に低いレベルまで低下させました（図 7c）。 Ror2 枯渇時の PKC 活性は、GSK3β 活性の上昇を引き起こす原因の 1 つである可能性があります。 興味深いことに、GSK3βの安定性は増加する一方で、PKC阻害は、β-カテニンのリン酸化/発現レベルと標準的なWnt標的遺伝子発現によってそれぞれ判断される、β-カテニンの安定性とβ-カテニン依存性の転写活性に対してわずかな影響しか与えませんでした（図7cおよび補足）図9a)。 これらのデータは、PKC が主に HFSC における GSK3β の細胞質プールを調節することを示唆しています。 さらに、GSK3βがHFSCのNRF2活性を負に調節するという事実と一致して（図5j）、GSK3βを安定化するPKC阻害はNRF2活性の低下をもたらしましたが、AMPK活性化には有意な影響を示さなかった（補足図9b）。 まとめると、我々の結果は、Wnt依存性シグナル伝達の活性化を損なうことに加えて、ROR2の喪失によりPKCの下方制御も生じ、それがGSK3βの安定化とNRF2の不活性化に寄与し、それによって不均衡な酸化反応を引き起こす可能性があることを示唆している。

我々は、ROR2発現が休止期後期および高齢のHFのβ-cat cKO HFSCで上昇したことを示しました（補足図6）。 興味深いことに、後期テロゲンHFのこれらのβ-cat cKO HFSC（補足図10a）および高齢動物（補足図10b）でもPKC発現の増加が検出されました。 PKCがβ-cat cKO HFSCにおいてROR2の下流で役割を果たすかどうかを決定するために、我々は、第2休止期中にβ-cat CtrlマウスおよびcKOマウスの背中の皮膚にPKCiを適用することによってPKC活性を阻害した（図7d、上）。 注目すべきことに、PKCiの適用後1週間で、β-cat cKO HFSCはすでに皮脂細胞分化を受けており、治療後3週間までにβ-cat cKO HFの77％がSGの拡大を伴ってバルジコンパートメントを失いました（図7dおよび補足図）。 .10c）。 PKC阻害によるβ-cat cKO HFの表現型は、β-cat cKO HFSCにおけるRor2枯渇の影響を再現しており、PKCがHFSC維持の調節においてROR2と同じ軸で作用することを示唆している。 さらに、HFSCステムネス遺伝子の下方制御におけるPKC阻害の効果は、β-cat Ctrl HFSCよりもβ-cat cKO HFSCの方が大きいことがわかり（図7e）、β-cat cKO HFSCのPKCがROR2の下流で役割を果たしていることが示唆されましたHFSCメンテナンス中。 我々の総合的な発見は、特に HFSC が適切に分化できない場合には、ROR2 依存性の制御が HFSC の増殖と維持に不可欠であるという説得力のある証拠を提供します。

Wnt シグナル伝達が幹細胞の挙動をどのように調節するかについての広範な研究は、β-カテニン依存性の標準的な Wnt 経路に焦点を当ててきましたが、幹細胞ニッチにおける β-カテニン非依存性シグナル伝達に関する情報は非常に限られています。 この概念的なギャップにより、HFをモデルシステムとして使用して、幹細胞の制御におけるWnt受容体ROR2の機能的重要性を研究することができました。 我々は、遺伝子マウスモデルを用いて、ROR2がHFSCの自己複製と長期維持に不可欠であることを示した。 培養HFSCを用いたさらなる分析により、ROR2は、PKC、JNK、および低分子GTPアーゼの活性化を通じてWnt5aによって活性化される非標準的Wntシグナル伝達および遊走を伝達するだけでなく、GSK3βの調節を介してHFSCにおける標準的Wnt標的遺伝子のWnt3a誘導性発現にも必要であることが実証された。安定性。 驚くべきことに、HFSCの維持に関与するROR2依存性調節を探索することにより、HFSCゲノム完全性の維持に重要なATM/ATR依存性DDRの調節におけるこれまで認識されていなかったROR2の機能が明らかになった。 最後に、β-カテニンヌルHFSCを用いた我々の分析により、特に適切に分化できないHFSCを制御不能な損失から保護する際のROR2-PKCシグナル伝達の代償的な役割がさらに明らかになった。 まとめると、我々の結果は、幹細胞の状況においてWnt受容体によって相互調節されるシグナル伝達ネットワークについての洞察を提供する(図7f)。

いくつかの研究は、ROR2 が Wnt/β-カテニンシグナル伝達の Wnt5a 依存性拮抗作用を媒介するという概念を支持しています 22、30、31、32、33。 しかし、我々のデータは、ROR2がWnt5a依存性シグナル伝達の活性化に関与しているだけでなく、HFSCにおける標準的なWnt活性化転写制御にも不可欠であることを示している。 我々は、標準的なWnt標的遺伝子が、脱毛誘発性HFSC活性化時および成長期開始時に、Ror2枯渇HFSCにおいて下方制御され、これらのプロセスは主にWnt/β-カテニンシグナル伝達によって支配され、毛周期開始を促進することを示した61,63。 また、Ror2 の枯渇により、解放された GSK3β 活性により、培養 HFSC における Wnt3a 誘導性の転写活性化が減少することもわかりました。 インビボ分析とインビトロ分析の両方から、ROR2はGSK3βの安定性の制御を介してHFSCにおけるWnt/β-カテニンシグナル伝達に拮抗するよりも活性化に有利であることが示されている。 我々の発見は、過剰発現したROR2が、Wnt/β-カテニンシグナル伝達レポーターによって測定されるWnt3a誘導性β-カテニンシグナル伝達活性を増強できることを示す研究と一致している31,35,36。 しかし、我々の研究モデルは、Wnt/β-カテニンシグナル伝達の調節における内因性ROR2の作用を決定することを可能にする生理学的背景を提供する。

HFSC は、毛周期を通じて、Wnt4 や Wnt11 などの非標準 Wnt リガンドが豊富なニッチに存在することが示されており、維持のために HFSC で非標準 Wnt シグナル伝達が活性化されている可能性が示唆されています。 私たちの研究では、ROR2 が HFSC における非標準的な Wnt 誘導シグナル伝達の活性化に必須であること、および HFSC の集団は ROR2 なしでは維持できないことを実証しました。 さらに、標準的な Wnt シグナル伝達が抑制されている β-cat cKO HFSC では、ROR2 が上方制御され、β-カテニン欠損 HFSC を損失から保護します。 これらすべての発見は、非標準的Wntによって少なくとも部分的に活性化されるROR2依存性制御が、HFSCを静止状態および/または活性化状態に維持する上で重要な役割を果たすというモデルを裏付ける。 培養中の Ror2 枯渇 HFSC を調べることにより、HFSC の長期維持に重要な ATM/ATR 媒介 DDR における ROR2 依存性制御を特定しました。 しかし、このメカニズムがそのニッチに存在するHFSCによって利用されているかどうか、またROR2によるDDRの制御がWntに依存しているかどうかは依然として不明である。 したがって、将来の研究は、ROR2媒介制御におけるWnt依存性の分析と、ROR2相互作用タンパク質の同定などによる、上記制御の根底にあるROR2の機構の解読に焦点を当てる必要がある。

in vivo マウスモデルを用いた解析では、Ror2 枯渇 HFSC の集団は 1 回目の HF 再生後に失われたものの、プロセス後に回復した Ror2 cKO HFSC は次の再生で HF 系統を維持し補充することができたことが示されています。 しかし、FACS 精製 Ror2 cKO HFSC は、増殖を促進する培地中で長期間培養を維持することができませんでした。 インビボおよび培養におけるＨＦＳＣ生存におけるこの不一致は、おそらくＨＦＳＣ増殖頻度の違いによるものである。 本来のニッチに存在する HFSC は、毛周期が始まるまで静止状態に維持されます。 成長期の開始時であっても、HFSC のサブセットのみが自己複製および再生のために増殖します。 それどころか、培養中の HFSC は常に増殖しているため、HFSC は DNA 損傷を受けやすくなります。 ATM/ATR 依存性 DDR における Ror2 枯渇 HFSC の欠損を考慮すると、高頻度の DNA 複製により DNA 損傷が急速に蓄積され、その後細胞周期の停止または細胞死が引き起こされる可能性があります。 これは、培養中の Ror2 cKO HFSC がニッチに存在するものよりも強い表現型を示した理由を説明します。

正規および非正規Wntシグナル伝達に関与するROR2の二重の役割に関する我々の同定は、細胞状態の安定性を維持するために、細胞が異なるWntシグナル伝達コンポーネントを利用してWntシグナル伝達ネットワークを構築しているという考えを具体化した。 ROR2 が状態特異的なシグナルを伝達する能力には、共受容体、相互作用タンパク質、または下流エフェクターの利用可能性が関与している可能性があります。 したがって、ROR2依存性シグナル伝達は細胞型特異的な効果を引き起こし、状況依存的な機能的結果をもたらす可能性があります。 この最後の推測は、複数の機能を達成するために必要な柔軟性をシステムに提供する可能性があります。 今後の研究では、HFSCの自己複製と維持に寄与するROR2依存性の標準的Wntシグナル伝達と非標準的Wntシグナル伝達との間の相互作用を掘り下げる必要がある。

ルーヴァン・カトリック大学の大学動物倫理委員会のガイドラインに従ってマウスを飼育し、治療した。 すべての実験手順はベルギーの動物福祉規制に従って実施されました。 すべての実験用マウスは、周囲温度 20 ～ 24 °C、湿度範囲 45 ～ 65% の 12:12 の明暗サイクルで飼育されます。 C57BL/6J バックグラウンドの K15CrePGR および Ror2fl/fl マウスを Jackson Laboratory から入手しました。 誘導性ノックアウトマウス系統は、K15CrePGR79、Ror2fl/flおよび/またはCtnnb1fl/fl、80、ROSA26LSL-YFP、81を交配することによって生成された。 Ror2 cKO およびその対照同腹子を生成する戦略は、K15CrePGR+;Ror2+/fl;Rosa26LSL-YFP 雄を Ror2fl/fl と交配することでした。 Rosa26LSL-YFPのメス。 Ror2 cKO マウスの対照動物は、性別が一致した Ror2 ヘテロ接合型 (Cre+) 同腹子、または Ror2 cKO マウスの同腹子に Ror2 ヘテロ接合型マウスが含まれない場合にのみ野生型 (Cre-) 同腹子でした。 Cre-リコンビナーゼ活性は、P18、P21、および P24 に RU486 (1 mg/マウス; TCI Europe NV) を腹腔内注射し、P21 ～ P25 にエタノール中の 4% RU486 を毎日局所投与することによって誘導されました。 同期した HFSC 活性化を誘導するために、P55 で麻酔をかけたマウスに HF 脱毛を実行しました。 ＰＫＣ阻害剤治療のために、アセトン（１μｇ／μｌ）中のＧＦ１０９２０３Ｘ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）１００μｇ、またはアセトン単独を、３日間隔日でＰ５５マウスの背中の皮膚に適用した。 実験は、性別、年齢、系統が一致したペア、主に同腹子に基づいて計画され、3 ペア以上のサンプルセットで繰り返されました。 表現型と得られた結果は、雄と雌のペアの両方で再現可能でした。

FACS 精製手順は以前に記載されているとおりです 63,78。 簡単に説明すると、背部皮膚を採取し、脂肪除去のために廃棄し、0.25% トリプシン中で 30 分間 (メス) または 40 分間 (オス) 37 °C でインキュベートしました。 表皮細胞およびHF細胞を削り取り、細胞懸濁液を70および40μmのセルストレーナー(Fischer Scientific)を通して濾過した。 収集した細胞を4% FBSを含むPBSに懸濁し、FACSの前に抗体とともにインキュベートしました。 次いで、FACS Diva v8.0.1ソフトウェアを備えたFACS Aria III (BD Biosciences)を使用して、染色された細胞を分類した。 死細胞を除外するために、Fixable Viability Dye eFluor 780 を使用しました。 次に、生きている HFSC を、インテグリン α6、CD34、およびサイトゾル YFP の表面発現に基づいて分類しました。 FACSゲーティングスキームは補足図11に示されています。細胞は、RNA精製用のTRI試薬（Sigma-Aldrich）、タンパク質精製用のプレコート15ml Flaconチューブ、またはコロニー形成用のフィーダー細胞を含む培地のいずれかに収集されました。

皮膚生検を収集し、4% パラホルムアルデヒド中で 4 °C で 4 時間固定し、次に 30% ショ糖に 4 °C で一晩浸漬してから、OCT コンパウンドに包埋しました。 皮膚ホールマウントの場合、背中の皮膚から脂肪を除去し、20 mM EDTA を補充した 2 mg/ml ディスパーゼ (Thermo Fisher Scientific) 中で 4 °C で一晩インキュベートしました。 次に、毛包が付着した皮膚の表皮を真皮から剥がし、4% PFA 中で室温 (RT) で 30 分間固定しました。 洗浄したホールマウントスキンは、さらに使用するために 4 °C で PBS に保存しました。

免疫蛍光検査では、7 µm の組織切片を固定、洗浄し、0.5% Triton-X100 で 20 分間透過処理しました。 次に、切片を免疫蛍光ブロッキング緩衝液（0.3% Triton X-100、1% ウシ血清アルブミン、1% ゼラチン、5% 正常ヤギ血清、5% 正常ロバ血清を含む PBS）中で室温で 1 時間インキュベートし、その後、一次緩衝液でインキュベートしました。抗体を 4 °C で一晩保存します。 該当する場合、MOM Fluorescein Kit (Vector Laboratories) を使用して、一次マウスモノクローナル抗体の非特異的結合を防止しました。 組織切片を洗浄し、Alexa Fluor結合二次抗体(Jackson ImmunoResearch)とともにRTで1時間インキュベートした後、DAPI(Roth)を含む封入剤で封入した。 ホールマウント組織の場合、前述のように、一次抗体を 4 °C で一晩インキュベートして免疫染色を実行しました63。 免疫蛍光染色の画像は、Axio Vert.A1 蛍光顕微鏡 (Zeiss) 上の Zen ソフトウェア v3.0 (Zeiss) または Axio Observer Z1 共焦点顕微鏡 (Zeiss) 上の Zen ソフトウェア v2.6 (Zeiss) を使用して取得しました。 蛍光強度はImageJを用いて測定した。

in vivo で HFSC 増殖を検出するために、マウスあたり 1 mg の EdU (5-エチニル-2'-デオキシウリジン; TCI Europe) を 12 時間間隔で 2 回腹腔内に 24 時間注射し、その後皮膚サンプルを収集しました。 in vitroでのEdU標識アッセイでは、10μg/mlのフィブロネクチン(Merck Millipore)でコーティングしたNunc Lab-Tek II Chamber Slides(Thermo Fisher Scientific)上でHFSCを増殖させた。 細胞をDMSO (溶媒)、2 μMのSP600125 (JNKi)、または0.5 μMのGF109203X (PKCi)とともに24時間インキュベートし、検出前に10 μM EdUで4時間標識しました。 取り込まれたEdUは、メーカーの指示に基づいて、Click-iT EdU Alexa Fluor 647イメージングキット(Thermo Fisher Scientific)によって検出されました。

コロニー形成アッセイでは、FACS 精製 HFSC を、マイトマイシン C 処理 J2 3T3 マウス線維芽細胞フィーダーを含む 6 ウェル プレートに 20,000 細胞/ウェル (成長期開始期 HF の場合) または 33,000 細胞/ウェル (休止期の HF の場合) で播種しました ( H. Green 研究室の同意に基づき、E. Fuchs 研究室からの親切な贈り物)。 2 週間の共培養後、コロニーを 4% パラホルムアルデヒドで固定し、1% ローダミン B で染色しました。サイズが 3 mm2 以上のコロニーの数を分析のために数えました。 長期継代実験のために、各グループ6コロニーからなる3つの独立したグループをクローンシリンダー(Bel-Art)で採取し、24ウェルプレート内のマイトマイシンC処理線維芽細胞フィーダー上に継代した。 HFSC をトリプシン処理し、1:10 希釈でフィーダー上に 10 日ごとに 10 継代継代しました。 すべての単一コロニーからの Ror2 の発現は RT-qPCR によって検証されました。

Ror2fl/fl/ROSA26LSL-YFP マウスの背部皮膚からの FACS 精製 HFSC を、記載されているように 0.3 mM カルシウムを含む培地中のマイトマイシン C 処理線維芽細胞フィーダー上で培養および増殖させました 82。 10継代後、HFSCをフィーダーから取り外し、レンチウイルス感染の準備を整えました。 Wnt の処理では、HFSC を 0.5% FBS を含む培地で 16 時間飢餓状態にし、その後ビヒクル (PBS)、キャリアフリー 100 ng/ml Wnt3a (R&D Systems) または 300 ng/ml Wnt5a (R&D Systems) で処理しました。タンパク質精製の場合は採取前に 30 または 60 分間、または mRNA 精製の場合は 6 時間。 GSK3 または PKC 阻害剤の処理では、タンパク質抽出のために採取する前に、HFSC をビヒクル (DMSO)、1 μM の CHIR99021 (R&D Systems)、または 1 μM の GF109203X (R&D Systems) で 24 時間処理しました。

指向性細胞遊走アッセイについては、QCM 24 ウェル比色細胞遊走アッセイ (Merck) を製造業者のプロトコールに従って実施した。 集団細胞遊走能を分析するために、スクラッチ創傷遊走アッセイを実施した。 簡単に説明すると、フィーダーフリーの HFSC を培養してコンフルエントな単層に成長させた後、8 μg/ml のマイトマイシン C (Merck) を含むまたは含まない 1% FBS を含む培地中で HFSC 単層をピペット チップを使用して直線でこすり落としました。隙間を作るために。 ギャップ閉鎖の画像は、スクラッチ後 0、8、および 24 時間で位相差顕微鏡を使用して取得され、各時点のギャップは ImageJ を使用して測定されました。 提示されたデータは、3 回の独立した実験の平均です。

細胞周期分析では、HFSC の DNA を 10 μg/ml DAPI で 37 °C で 1 時間染色し、FACS Diva v8.0.1 ソフトウェア (BD Biosciences) を備えた LSR Fortessa フローサイトメーターで DNA 含有量を測定し、FlowJo を使用して分析しました。 v10.7.2 ソフトウェア。 細胞内 ROS のレベルを測定するために、HFSC を CellROX Deep Red 試薬 (Thermo Fisher Scientific) で染色し、メーカーの指示に従って LSR Fortessa フローサイトメーターで分析しました。

HEK293FT細胞（Thermo Fisher Scientific）を、pLKO.1レンチウイルス発現プラスミド、PAX2およびMD2ウイルスパッキングプラスミドを含むプラスミド混合物でCaCl2トランスフェクトした。 トランスフェクションの 48 時間後、トランスフェクトされた HEK293FT 細胞からのウイルスを含む上清を収集、濾過し、ポリブレン (Sigma-Aldrich) および追加の 10% FBS と混合してから、Ror2fl/fl/ROSA26LSL-YFP HFSC に適用しました。 ウイルス感染は、HFSC をウイルス含有混合物とともに 1100 × g、35 °C で 1 時間遠心分離することによって実行されました。 感染の5日後、HFSCはRFPおよび/またはYFPの発現に基づいてFACSによって精製されました。 以下のレンチウイルス発現プラスミドを使用しました: pLKO.1-NLS-iCre-mRFP (S. Beronja からの寄付)83、pLKO.1-MCS-mRFP (pLKO.1-NLS-iCre-mRFP に由来し、NLS-iCreは複数のクローニング サイトに置き換えられました)。

FACS で選別された細胞または培養細胞からの全 RNA を Direct-zol RNA MiniPrep キット (Zymo Research) で精製し、ProtoScript(r) II First Strand cDNA Synthesis Kit (New England Biolabs) で逆転写しました。 cDNA は、Thermoblock 96 Silver Block Real-Time PCR システム (Bio-Rad) 上の SYBR Green (Bio-Rad) 定量 PCR アッセイで指定のプライマーを使用して増幅され、サイクル数は CFX Manager v3.1 ソフトウェアによって記録されました。 相対発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子 Ppib2 または Rps16 の PCR 増幅に対して正規化されました。 mRNA 発現に使用されるプライマーは補足表 1 にリストされています。qPCR 分析のエラーバーは、各データセットに示されている独立した生物学的複製 (n ≥ 3) から計算されました。

HFSCを飢餓状態にしてから、Small GTPase活性化アッセイのために採取する前に、300 ng/mlのWnt5aで2時間処理しました。 Small GTPase 活性化アッセイについては、Rac1/Cdc42 活性化アッセイ コンボ キット (Cell Biolabs) を製造元のプロトコールに従って実施しました。 イムノブロット分析では、RIPA バッファー (50 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸 Na、0.1% SDS、1 mM EDTA、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤) を使用して細胞からタンパク質を抽出しました。 。 次に、タンパク質溶解物を 4 ～ 12% Bis-Tris ゲル (Thermo Fisher Scientific) にロードし、ニトロセルロース膜 (Thermo Fisher Scientific) に転写しました。 移した膜を、TBST 緩衝液中の 5% BSA を用いて室温で 1 時間ブロックし、一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 インキュベーション後、ブロットを洗浄し、HRP 結合二次抗体 (Jackson ImmunoResearch) とともに 1 時間インキュベートしました。 化学発光検出試薬 (SuperSignal West 基質、Thermo Fisher Scientific) を使用してブロットを展開し、Fusion-Capt Advance Solo 4S v16.16b ソフトウェアを備えた Fusion SL イメージング システム (Vilber) を使用してシグナルを検出しました。

FACS には次の抗体 (Ab) を使用しました: 生存率色素 F780 (1:200、65-0865)、インテグリン α6 (1:500、PE 結合、クローン GoH3、12-0495)、および CD34 (1:100、 eBiosciences の Alexa Fluor 660 結合、クローン RAM34、50-0341）。 イムノブロッティングには次の Abs を使用しました: Developmental Studies Hybridoma Bank の ROR2 (Ror2)。 ROR1 (クローン D6T8C、16540)、p-JNKT183/Y185 (クローン 81E11、4668)、JNK (クローン 56G8、9258)、p-PKCS660 (9371)、PKCα (2056)、Dvl2 (クローン 30D2、3224)、p- LRP6S1490 (2568)、LRP6 (クローン C5C7、2560)、p-GSK3βS9 (9336)、GSK3β (クローン 27C10、9315)、p-β-cateninS33/37/T41 (9561)、Axin1 (クローン C76H11、2087)、CK1 (2655)、p-ATMS1981 (クローン D6H9、5883)、ATM (クローン D2E2、2873)、p-ATRS428 (2853)、ATR (2790)、p-CHK2T68 (2661)、CHK2 (2662)、p-CHK1S345 (クローン 133D3、2348)、CHK1 (クローン 2G1D5、2360)、p-AMPKT172 (クローン 40H9、2535)、AMPKα (2532)、α-チューブリン (2144)、ラミン B1 (クローン D9V6H、13435)、ビンキュリン (クローン E1E9V、 Cell Signaling Technology の 13901) および p-ATM/ATR 基板 (2851)。 p-NRF2S40 (クローン EP1809Y、ab76026) および NRF2 (ab137550) (アブカム製)。 Sigma-Aldrich の β-カテニン (クローン 15B8、C7207) および β-アクチン (クローン AC-74、A2228)。 eBiosciences の CD34 (クローン RAM34、13-0341)。 Merck-Millipore の Rac1 (クローン 23A8、05-389)、Cdc42 (07-1466)、および GAPDH (クローン 6C5、MAB374)。 Biolegend の Krt5 (905901) および Krt15 (833901)。 BD Biosciences の p-GSK3βY216 (クローン 13A、612313)。 Jackson ImmunoResearch の HRP 結合二次抗体 (715-035-150、711-035-152、712-035-150)。 イムノブロッティングに使用したすべての一次抗体は 1:1000 希釈で、二次抗体は 1:4000 でした。 免疫染色には以下の Abs を使用しました: Developmental Studies Hybridoma Bank の ROR2 (1:100、Ror2)。 ROR1 (1:100、16540)、p-JNKT183/Y185 (1:100、4668)、JNK (1:100、9258)、p-PKCS660 (1:100、9371)、PKCα (1:100、2056) 、γH2AX (1:200、BET A300-081A-M)、Cell Signaling Technology製。 GFP (1:1000、ab13970) アブカム製。 Sigma-Aldrich の β-カテニン (1:100、C7207)。 CD34 (1:100、13-0341) (eBiosciences 製)。 Merck-Millipore の 8-oxoG (1:100、クローン 483.15、MAB3560)。 蛍光色素結合二次抗体 (703-545-155、715-545-150、715-585-150、711-545-152、711-585-152、712-545-150、712-585-150)ジャクソン免疫リサーチ。

動物実験は同数の雄と雌のマウスで実施されました。 表現型は、少なくとも 3 頭の性対同腹子 (n ≥ 3) を表します。 実験はランダム化されておらず、研究者はデータ収集中に盲検化されていませんでした。 すべての RT-qPCR 結果は、少なくとも 3 匹の生物学的に独立した動物または独立した実験から得られます。 組織学的分析、免疫ブロッティングおよび免疫蛍光染色の結果はすべて、少なくとも 2 つの独立した実験の代表です。 グラフは、GraphPad Prism 8 を使用して表示されました。箱ひげ図は、中央値 (箱内の線)、25 ～ 75 パーセンタイル (箱の下と上の線)、および 10 ～ 90 パーセンタイル (下と上のひげ) として表示されます。 ）。 ドットプロットは平均±SEMとして表されました。 他のデータは平均±標準偏差として報告されました。 * p < 0.05、** p < 0.005、*** p < 0.0005、または図の凡例で指定された p 値。 統計分析は、すべての実験について対応のない両側スチューデントの t 検定によって決定されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

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FACS ソーティング (de Duve Institute の FACS 施設) について Nicolas Dauguet に感謝します。 Slobodan Beronja 氏、Valeri Vasioukhin 氏、Frederic Lemaigre 氏、Christophe Pierreux 氏によるディスカッションとコメント。 AV および CMRL は、科学財団 (FNRS) の FRIA フェローシップ (AV に対して 1.E136.15、CMRL に対して 1.E041.16) およびルーヴァン カトリック大学 (UCLouvain) からのパトリモワン フェローシップによって支援されています。 GC は、UCLouvain の FSR フェローであり、FNRS の Aspirant フェロー (1.A551.19) です。 CKC は、Fondation Contre le Cancer とカリフォルニア大学ルーヴァン校の FSR ポスドクフェローシップによって支援されています。 W.-HL は FNRS の独立研究者です。 この研究は、FNRS (Ulysse-F.6002.14 および PDR-T.0078.16)、ジョゼフ メイシン財団 (2016-2018)、およびコントレ ル キャンサー財団 (FAF-F/2016/) からの助成金 (W.-HL へ) によって支援されました。 792）。

Anthony Veltri、Christopher MR Lang などの著者も同様に貢献しました。

ド・デューヴ研究所、ルーヴァン・カトリック大学、1200、ブリュッセル、ベルギー

アンソニー・ヴェルトリ、クリストファー・MR・ラング、ガイア・カンジョッティ、チム・ケイ・チャン、ウェンホイ・リエン

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AV と W.-HL は研究と設計実験を考案しました。 AV は実験の大部分を実行し、データを分析し、図を作成しました。 CL はレンチウイルス感染アッセイを開発し、改訂中に重要な実験を実施しました。 GC は組織学分析、細胞培養、RT-qPCR 実験の一部を実施しました。 CKC は、FACS 実験、免疫ブロット法、細胞周期分析、ROS 測定の一部を実施しました。 W.-HL は研究を監督し、いくつかの細胞培養実験を実施し、データを分析し、図を作成し、論文を執筆しました。 著者全員が知的意見を提供し、最終原稿を承認しました。

Wen-Hui Lien への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Mingxing Lei 氏、Daniela Ungureanu 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Veltri, A.、Lang, CMR、Cangiotti, G. 他 ROR2 は、毛包幹細胞の自己複製と維持を制御します。 Nat Commun 13、4449 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32239-7

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受信日: 2019 年 6 月 26 日

受理日: 2022 年 7 月 21 日

公開日: 2022 年 8 月 1 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32239-7

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